李一經(jīng)，韓樂(lè)濛，唐麗杰，馬孫婷，布哈里，姜艷平，崔　文（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

雞腸道定殖乳酸桿菌分離鑒定及藥物敏感性分析

李一經(jīng)，韓樂(lè)濛，唐麗杰，馬孫婷，布哈里，姜艷平，崔文
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

為篩選分析雞腸道內(nèi)定殖乳酸桿菌及其對(duì)抗生素藥物敏感性，選取健康雞腸道內(nèi)容物，利用MRSCaCO3培養(yǎng)基平板，42℃厭氧培養(yǎng)，選擇革蘭氏陽(yáng)性、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢、桿狀細(xì)菌檢測(cè)過(guò)氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原活性，糖發(fā)酵反應(yīng)管作生化反應(yīng)表型鑒定，利用PCR擴(kuò)增16S rRNA并測(cè)定序列。結(jié)果表明，獲得8株乳酸桿菌，其中包括3株Lactobacillus crispatus、2株Lactobacillus johnsonii、2株Lactobacillus salivarius和1株Lactobacillus saerimneri。8株乳酸桿菌在37和42℃均生長(zhǎng)良好；抑菌試驗(yàn)表明，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性及陰性細(xì)菌均有一定抑菌活性。體外粘附試驗(yàn)表明，8株乳酸桿菌均具有一定粘附特性，可在腸道內(nèi)定殖?？股孛舾行栽囼?yàn)表明，8株乳酸桿菌對(duì)多種抗生素敏感。

雞腸道；乳酸桿菌；分離鑒定；抑菌活性；體外粘附能力；藥物敏感性

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間2016-6-17 15:21:50[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.008.htm l

李一經(jīng),韓樂(lè)濛,唐麗杰,等.雞腸道定殖乳酸桿菌分離鑒定及藥物敏感性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(6):51-59.

Li Yijing,Han Lemeng,Tang Lijie,et al.Separation and identification of colonized Lactobacillus from chickens intestine and analyzation antibiotics susceptibility[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):51-59.(in Chinese with English abstract)

乳酸菌（Lactic acid bacteria,LAB）能發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌，而非系統(tǒng)分類中嚴(yán)格意義上的科或?qū)賉1]，目前已發(fā)現(xiàn)乳酸菌在細(xì)菌分類學(xué)上至少包括以乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、明串珠球菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）等為代表的8個(gè)屬。絕大多數(shù)為厭氧或兼性厭氧化能異養(yǎng)菌，生長(zhǎng)繁殖于厭氧或微耗氧、礦物質(zhì)和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物豐富酸性環(huán)境中。乳酸桿菌在動(dòng)物消化道中含量較高，約占正常菌群10%[2]，是人和動(dòng)物正常菌群（Normal microbiota）組成部分。研究表明，乳酸桿菌是雞嗉囊、空腸、回腸、盲腸和直腸中優(yōu)勢(shì)菌群，通常作為飼料安全益生菌劑添加[3-4]。

乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、芽孢桿菌屬和鏈球菌屬是目前生產(chǎn)活菌制劑常用菌種[5]。乳酸桿菌大量存在于動(dòng)物腸道，維持腸道微生物群系“平衡”。乳酸桿菌制劑已被應(yīng)用于腸道微生態(tài)治療。乳酸桿菌可作為免疫接種活菌疫苗載體，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用潛力較大[6]。雞腸道黏膜上皮細(xì)胞表面及其周圍粘附大量乳酸桿菌，可在小腸黏膜表面形成屏障，阻礙其他細(xì)菌特別是有害菌與小腸黏膜上皮細(xì)胞接觸，減少有害菌通過(guò)腸道侵染雞體機(jī)會(huì)。因此選擇宿主自身且能定殖于腸道內(nèi)乳酸桿菌菌株作活菌疫苗載體具有較大優(yōu)勢(shì)[7-9]。本研究從健康雞腸道內(nèi)分離乳酸桿菌，開(kāi)展形態(tài)、生化反應(yīng)及分子生物學(xué)鑒定，抑菌活性試驗(yàn)，體外粘附試驗(yàn)及藥物敏感性試驗(yàn)分析，為雞腸道內(nèi)定殖乳酸桿菌生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料方法

1.1材料

1.1.1菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、李氏桿菌（Listeria）、巴氏桿菌（Pasteurella）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、干酪乳桿菌L393（Lactobacillus casei393）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)試驗(yàn)室提供。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選取4只20日齡健康肉雞，購(gòu)自哈爾濱市勝利養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.1.3引物

根據(jù)已發(fā)表乳酸桿菌基因組16S rRNA基因序列合成引物27F（5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'）及1495R（5'CTACGGCTACCTTGTTACGA 3'），引物由金維智有限公司合成。

1.2方法

1.2.1雞腸道乳酸菌分離及生化反應(yīng)特性鑒定

將健康雞處死，體表75%乙醇消毒處理，迅速解剖取十二指腸、空腸、回腸、盲腸，生理鹽水灌洗清除內(nèi)容物，用干凈載玻片刮取雞腸黏膜，約取0.5 g樣品，置于裝有4.5mL滅菌生理鹽水試管中，充分震蕩，混合均勻，稀釋度為10-1，吸取0.5mL至另一試管中，將樣品依次稀釋至10-8，再吸取各稀釋度樣品300μL，滴種到MRS-CaCO3培養(yǎng)基平板上，涂布棒將其涂布均勻，42℃厭氧培養(yǎng)24~48 h，選擇其中革蘭氏陽(yáng)性、不運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢、桿狀細(xì)菌做過(guò)氧化氫酶、氧化酶和硝酸鹽還原活性試驗(yàn)，3者均為陰性初步判定為乳酸桿菌。將得到菌株純化，直到鏡下觀察，菌體形態(tài)大小均一、無(wú)雜菌為止。30%（V/V）甘油保存于-80℃。

1.2.2乳酸桿菌16SrRNA鑒定

分離菌株全部用糖發(fā)酵反應(yīng)管作基于生化反應(yīng)表型鑒定，鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》對(duì)比后歸類。細(xì)菌基因組提取試劑盒提取菌株DNA，以乳酸桿菌屬16S rRNA通用引物27F、1495R擴(kuò)增目的片段確認(rèn)菌株歸類。DNA回收試劑盒純化回收。將純化回收PCR產(chǎn)物分別送至生工生物工程（上海）有限公司及金唯智生物科技有限公司序列測(cè)定。DNAMAN軟件分析測(cè)序結(jié)果，并通過(guò)Blast種屬鑒定。

1.2.3乳酸桿菌37和42℃下生長(zhǎng)特性測(cè)定

分離菌株經(jīng)鑒定后，歸為8類，每一類選擇一株作代表測(cè)定生長(zhǎng)曲線，生長(zhǎng)曲線測(cè)定具體操作如下：

挑選生長(zhǎng)健壯劃線復(fù)蘇菌落接種于5mL液體MRS培養(yǎng)基中，分別于37和42℃孵育過(guò)夜。取適量菌液用微量分光光度計(jì)測(cè)菌液濃度后以1%接種液體MRS，混勻，分裝到12支試管，10 mL每管。37℃靜置培養(yǎng)，以未接種MRS為對(duì)照置于相同溫度下。測(cè)定菌液初始OD600，記錄。每隔2 h取出1只試管測(cè)定OD600，以同溫度下未接種MRS作對(duì)照，連續(xù)測(cè)24 h，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4抑菌活性檢測(cè)

打孔法對(duì)篩選的8株乳桿菌作4種病原菌抑菌活性測(cè)試試驗(yàn)。指示菌包括巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、李氏桿菌及鼠傷寒沙門氏菌。將分離菌株于MRS肉湯中培養(yǎng)，指示菌株于LB肉湯中培養(yǎng)，12~16 h；指示菌菌液用LB液體調(diào)整OD600至1.0；將調(diào)好OD600指示菌液涂布LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，100μL·板-1；待干后，打孔器打孔（9mm·孔-1），4孔·板-1；每孔分別加入8株分離菌，置于42℃靜置向上培養(yǎng)，16~24 h后游標(biāo)卡尺（0.02mm精度）測(cè)量抑菌圈直徑，以肉眼未見(jiàn)菌落生長(zhǎng)為邊界，記錄結(jié)果。

1.2.5乳酸桿菌體外粘附試驗(yàn)

檢測(cè)分離到的8株乳酸桿菌及實(shí)驗(yàn)室保存菌L393（Lactobacillus casei393）在Basement Membrane Matrigel（購(gòu)自BD公司）上的粘附能力。依說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備BMM工作液，參照文獻(xiàn)[10]方法作粘附試驗(yàn)。

BMM工作液配制：將BMM于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜融化。預(yù)冷基礎(chǔ)1640培養(yǎng)基以1?20比例稀釋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乳酸桿菌菌液制備：將8株乳酸菌分別接種MRS肉湯，42℃（L393為37℃）靜置，厭氧培養(yǎng)至OD600=1.0；菌體培養(yǎng)物4℃低溫下3 000 r·min-1離心10min，菌體無(wú)菌PBS洗兩次；無(wú)菌PBS調(diào)整菌體濃度為5×106cfu·mL-1備用。

粘附試驗(yàn)步驟：將圓形爬片在無(wú)菌條件下放入24孔板內(nèi)，封閉24孔板，放入4℃冰箱中預(yù)冷2 h。預(yù)冷槍頭將BMM工作液包被于24孔板內(nèi)爬片上，每孔100μL。室溫放置1 h。基礎(chǔ)1640培養(yǎng)基輕柔洗去爬片上未成膠BMM工作液。含2%牛血清白蛋白無(wú)菌PBS（2%BSA-PBS）包被各孔（每孔200μL），室溫放置2 h。將2%BSA-PBS吸凈，調(diào)整好濃度菌液加入孔中，每孔200μL，每株菌2個(gè)平行樣，室溫孵育2 h。吸去菌液，無(wú)菌PBS輕柔清洗1次后結(jié)晶紫染液染色粘附細(xì)菌。將爬片取出，100倍油鏡下觀察，每張爬片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。計(jì)算各株菌視野下菌數(shù)平均值。

1.2.6藥物敏感性試驗(yàn)

微生物藥敏紙片（8大類24種，購(gòu)自浙江天合微生物試劑有限公司）測(cè)試分離株耐藥譜，確定所選菌株藥物敏感性。取培養(yǎng)過(guò)夜菌液，測(cè)其OD600，并取菌液12 000 r·min-1離心5min，離心結(jié)束后棄上清，滅菌生理鹽水重懸菌體，12 000 r·min-1，離心3min后重復(fù)上述步驟1次。滅菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌體OD600在0.08~0.1（相當(dāng)于108cfu·mL-1），取350μL調(diào)節(jié)好濃度菌液涂布MRS瓊脂平板。待干后（約需15min），貼放標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片，4片每板，42℃倒置培養(yǎng)18~24 h后游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

2　結(jié)果與分析

2.1雞腸道乳酸菌分離及生化反應(yīng)特性鑒定

從雞腸道內(nèi)共分離到42株菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，挑選其中14株革蘭氏陽(yáng)性桿菌純化，經(jīng)純化5~10代后，獲得單一革蘭氏陽(yáng)性桿菌。鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　革蘭氏染色鏡檢(100×)Fig.1 Gram staining(100×)

對(duì)所分離14株革蘭氏陽(yáng)性桿菌作生化反應(yīng)測(cè)試，根據(jù)糖發(fā)酵反應(yīng)不同結(jié)果，篩選8株表型不同菌株（5-1-1,5-3-2,6-3，N-7，N-11，N-14，N-23及M-11），生化反應(yīng)結(jié)果符合乳酸桿菌特性（見(jiàn)表1）。

2.2乳酸桿菌16S rRNA鑒定

將8株菌作16S rRNA基因擴(kuò)增和序列測(cè)定，以提取基因組為模板，27F和1495R為引物，擴(kuò)增乳酸桿菌16S rRNA序列，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)約1 500 bp目的片段，與預(yù)期結(jié)果符合（見(jiàn)圖2）。

表1　雞腸道分離菌生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Biochemical characteristics of Lactobacillus species isolated from the intestines of chicken

圖2　基因組16S rRNA PCR結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA

將PCR產(chǎn)物純化測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBIBlast比對(duì)，進(jìn)一步確定8株菌分類，將序列上傳NCBI GenBank，獲取8株菌基因登錄號(hào)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3乳酸桿菌37和42℃生長(zhǎng)特性測(cè)定

37及42℃連續(xù)測(cè)定24 h內(nèi)生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖3、4）表明，所分離8株乳桿菌37和42℃均能生長(zhǎng)。42℃下生長(zhǎng)速度快于37℃。除5-1-1生長(zhǎng)明顯緩慢外，其余各株乳酸菌均在0~4 h處于遲緩期，5 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 h后進(jìn)入平穩(wěn)期。

由8株乳酸菌各自生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖5）可知，多株菌42℃下生長(zhǎng)速度略高于37℃，而平臺(tái)期總菌數(shù)略低于37℃。

表2　雞腸道乳桿菌鑒定結(jié)果及基因登錄號(hào)Table2 Molecular identification results of Lactobacillus spp.isolated fromchicken intestine and GenBank accession No.

圖3　37℃生長(zhǎng)曲線Fig.3 Grow th curve in 37℃

圖4　42℃生長(zhǎng)曲線Fig.4 Grow th cu rve in 42℃

圖5　8株乳酸菌生長(zhǎng)曲線Fig.5 Grow th curves of eight LAB isolates

2.4抑菌活性檢測(cè)

所篩選8株乳酸桿菌對(duì)4種致病菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。所有菌株均對(duì)金黃色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏桿菌及鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)一定抑制活性。

2.5乳桿菌體外粘附試驗(yàn)

所篩選8株乳酸桿菌與L393在BMM上粘附試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。3株卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispa?tus）5-3-2、5-1-1和N-11表現(xiàn)較強(qiáng)粘附能力，M-11（Lactobacillus saerimneri）與L393（Lactobacillus ca?sei393）粘附能力近似。而6-3和N-23（Lactobacil?lus johnsonii）及N-14和N-17（Lactobacillus salivari?us）粘附能力較弱。

表4　抑菌試驗(yàn)結(jié)果Table4 Antibiotic activity of the isolates against pathogenic bacteria

圖6　乳酸桿菌BMM粘附試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Adhesion of LAB to basement membrane Matrigel

2.6藥物敏感性試驗(yàn)

通過(guò)8大類24種抗生素微生物藥敏紙片（6mm）測(cè)試所篩選8株乳桿菌對(duì)藥物的敏感性。當(dāng)乳桿菌抑菌圈直徑大于相應(yīng)抗生素臨界點(diǎn)時(shí)，認(rèn)為此菌對(duì)該種抗生素敏感。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，6-3與N-23（Lactobacillus johnso?nii）及N-7與N-14（Lactobacillus salivarius）4株菌能耐受大部分抗生素（≥13種）。M-11（Lactobacillus saerimneri）及5-3-2、5-1-1、N-11（Lactobacillus crispatus）4株菌則對(duì)較少種類抗生素（≤10種）表現(xiàn)耐受性。

所有8個(gè)菌株均對(duì)慶大霉素（Gentamicin）、氨芐青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）和四環(huán)素（Tetracycline）不敏感。

表5　藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab le 5 Antibiotic sensitivity of the isolates

3　討論與結(jié)論

近年來(lái)，益生菌作為微生物添加劑和疫苗載體倍受關(guān)注，但益生菌株來(lái)源不同應(yīng)用效果不一致。益生菌株多由體外環(huán)境如發(fā)酵工業(yè)篩選得到，體內(nèi)外環(huán)境差異顯著，來(lái)自體外環(huán)境外源菌難以耐受體內(nèi)膽汁、胃中低pH作用，無(wú)法腸壁定殖。Fuller指出用作益生素的菌株具有生長(zhǎng)速度快，易吸附于上皮細(xì)胞特性，對(duì)胃腸道內(nèi)抑制因素具有抵抗力，能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等特點(diǎn)[11]。本試驗(yàn)直接從雞腸道黏膜分離乳酸菌，篩選及優(yōu)化乳酸菌株。

試驗(yàn)利用經(jīng)改良MRS培養(yǎng)基，在原有培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20%碳酸鈣，根據(jù)厭氧培養(yǎng)環(huán)境下菌株產(chǎn)酸分解碳酸鈣特性，篩選產(chǎn)酸性能較好乳酸菌。通過(guò)表型特征鑒定，篩選乳酸桿菌，根據(jù)糖發(fā)酵反應(yīng)分離到的菌株中篩選出8株。由于乳酸桿菌屬內(nèi)，部分種間糖發(fā)酵反應(yīng)差異小，需進(jìn)一步鑒定[12]?；?6SrRNA序列分析表明8株菌中3株為L(zhǎng)actobacillus crispatus、2株為L(zhǎng)actobacillus johnso?nii、2株為L(zhǎng)actobacillus salivarius、1株為L(zhǎng)actoba?cillus saerimneri。任大勇、鮑延娥等研究表明，卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）和唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）均有較高腸道粘附能力，是動(dòng)物消化道內(nèi)常在菌，已應(yīng)用于飼糧添加以改善產(chǎn)蛋雞生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[13-14]。體外粘附試驗(yàn)結(jié)果表明，這8株菌均有一定粘附能力，3株卷曲乳桿菌體外粘附能力顯著高于其他菌株，與Sun等研究結(jié)果一致[15]。粘附能力強(qiáng)有助于細(xì)菌在腸道內(nèi)更好定殖，作為生物工程菌時(shí)，可減少免疫次數(shù)和免疫量，提高免疫效率。Rodwell研究表明，Lactobacillus saerimneri由哺乳動(dòng)物消化道內(nèi)分離所得[16]，且Taweechotipatr等也證明，Lactobacil?lus saerimneri在人體內(nèi)具有抗炎癥特性并可作為候選益生菌[17]。

乳酸菌可作為抗生素替代品防治疾病。本試驗(yàn)篩選8株乳酸桿菌均對(duì)慶大霉素（Gentamicin）、氨芐青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）和四環(huán)素（Tetracycline）不敏感。研究表明，多株植物乳桿菌均對(duì)慶大霉素（Gentamicin）、氨芐青霉素（Ampicillin）和卡那霉素（Kanamycin）不敏感[18]，這可能是多數(shù)乳酸菌共同特征。此外，兩株約氏乳桿菌與兩株唾液乳桿菌均對(duì)多種抗生素具有耐藥性。乳酸桿菌耐藥性機(jī)制有待深入研究。

8株分離菌株具有抑菌活性，不僅能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌、李斯特菌），對(duì)革蘭氏陰性菌（巴氏桿菌、鼠傷寒沙門菌）也有較好抑制作用。分離菌株抑菌活性有利于維持腸道正常菌群平衡，是益生菌預(yù)期重要特性之一[18]。

8株菌37和42℃均生長(zhǎng)良好，表明其在實(shí)驗(yàn)室一般培養(yǎng)條件下及雞體內(nèi)（雞正常體溫為40~ 42℃）均可生長(zhǎng)。

綜上，本試驗(yàn)分離8株乳酸桿菌均有作為雞飼料益生菌制劑和活載體疫苗宿主菌株應(yīng)用潛力。

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Separation and identification of colonized Lactobacillus from chickens intestine and analyzation antibiotics susceptibility/LI Yijing,HAN Lemeng,TANG

Lijie,MA Sunting,Bukarhari M,JIANG Yanping,CUI Wen(School of Veterinary Medicines,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In order to select colonized Lactobacillus from chickens intestine and analyzation antibiotics susceptibility,Lactobacillus were isolated from the intestine of healthy chickens.After using MRS-CaCO3plates,anaerobic culturing in 42℃,bacterias those are Gram-positive,still,no spores and rod-like were tested by oxidase,catalase reaction,and biochemical reactions.Eight strains with different phenotype were carried 16S rRNA sequence analysis by using PCR,and the results showed that three of the eight strains were Lactobacillus crispatus,two strains were Lactobacillus johnsonii,two strains were Lactobacillus salivarius and one strain were Lactobacillus saerimneri.Eight strains were able to grow well in both 37 and 42℃.And all the strains exhibited sensitivity to various antibiotics,inhibited the growth of both Grampositive and Gram-negative bacteria.And the in vitro adherence test showed that all the isolates had the ability to adhere the guts.Antibiotics susceptibility test showed that eight strains were sensitive to many antibitics.

chicken intestine;Lactobacillus;separation and identification;antimicrobial activity;in vitro adherence ability;antibiotic susceptibility

S831

A

1005-9369（2016）06-0051-09

2016-04-05

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD12B01-4）

李一經(jīng)（1960-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail:yijingli@163.com