張娜，張紫燕，趙凌霞，姚怡，楊瑩，張建林，鄭國(guó)平

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原　030000

FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)與炎癥的關(guān)系

張娜，張紫燕，趙凌霞，姚怡，楊瑩，張建林，鄭國(guó)平

山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西太原030000

目的通過(guò)研究叉頭框蛋白1（forkhead transcription factors of O class 1，F(xiàn)oxO1）轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平和蛋白水平在巨噬細(xì)胞的表達(dá)以及檢測(cè)Foxo1干擾和過(guò)表達(dá)后巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子含量，從炎癥進(jìn)展的角度探討FoxO1轉(zhuǎn)錄因子與炎癥之間的關(guān)系。方法①利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬細(xì)胞Ana-1制作炎癥模型，ELISA測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α的濃度；②采用Real-Time PCR，Western Blot測(cè)FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平以及蛋白水平的含量；③利用脂質(zhì)體2 000將FoxO1 siRNA轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞，采用ELISA檢測(cè)對(duì)照組和干擾組分泌的炎癥因子IL-6、TNF-α的含量；④利用脂質(zhì)體2 000將FoxO1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞，采用ELISA檢測(cè)LPS組和過(guò)表達(dá)組炎癥因子IL-6、TNF-α的含量。結(jié)果①ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，在LPS的濃度為50 ng/mL時(shí)巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、TNF-α含量分別為2190、1124ng/mL，干預(yù)時(shí)間為36h時(shí)分別為2190、1995 ng/mL。此條件下炎癥因子含量最高；②Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS組FoxO1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平是對(duì)照組的0.36倍，蛋白水平的表達(dá)量是對(duì)照組的0.58倍；③Foxo1 siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α含量從782 ng/mL上升到1 290 ng/mL，IL-6的含量從161 ng/mL上升到251 ng/mL；4.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)FoxO1質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)顯示，與LPS組相比，過(guò)表達(dá)組巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α的含量從1 785 ng/mL下降到1 329 ng/mL，IL-6含量從486 ng/mL下降到317 ng/mL。結(jié)論LPS刺激巨噬細(xì)胞Ana-1產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子的釋放，同時(shí)下調(diào)Foxo1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平和蛋白水平的含量，特異性FoxO1基因沉默可上調(diào)炎癥因子的釋放。過(guò)表達(dá)FoxO1可以使炎癥反應(yīng)減輕，證明Foxo1轉(zhuǎn)錄因子參與巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。

FoxO1轉(zhuǎn)錄因子；巨噬細(xì)胞；炎癥反應(yīng)

炎癥是臨床上常見(jiàn)的病理生理反應(yīng)過(guò)程，任何能夠引起組織損傷的因素都可能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，而且持續(xù)的炎癥會(huì)導(dǎo)致器官和組織的功能障礙，因此如何控制炎癥是目前醫(yī)學(xué)界的一個(gè)難題。在炎癥過(guò)程中巨噬細(xì)胞扮演著比較重要角色。雖然巨噬細(xì)胞在損傷和組織修復(fù)中起著重要的保護(hù)作用，但是它的持續(xù)激活會(huì)促進(jìn)機(jī)體的病理狀態(tài)。研究表明巨噬細(xì)胞可根據(jù)接收的不同微環(huán)境信號(hào)被誘導(dǎo)成為不同極化狀態(tài)的巨噬細(xì)胞，從而執(zhí)行多種多樣的功能比如炎癥、細(xì)菌吞噬、免疫調(diào)節(jié)等［1］。FoxO1是Fox轉(zhuǎn)錄家族的重要成員，廣泛分布于機(jī)體的各類(lèi)組織和細(xì)胞中，其在胞漿內(nèi)的存在形式為磷酸化的FoxO1，上游主要受到PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)控，活化后的Akt可使FoxO1轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化由核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿而失去轉(zhuǎn)錄活性［2］。羅丹等［3］的研究顯示FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平的表達(dá)在膽汁淤積性肝纖維化的肝性炎癥中有低表達(dá)現(xiàn)象，因此該研究想探討在巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)中Foxo1的變化情況以及Foxo1的變化對(duì)炎癥的影響情況。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1試劑改良型RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清，ELISA試劑盒，Trizol Reagent、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipo2 000，SYBR GREEN實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液，凝膠制備試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液，Phospho-FoxO1 Rabbit mAb、FoxO1 Rabbit mAb、siRNA FoxO1，羊抗兔IgG。

1.1.2細(xì)胞巨噬細(xì)胞Ana-1（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組共分為4組。對(duì)照組為正常Ana-1細(xì)胞；LPS組為Ana-1細(xì)胞中加入LPS；干擾組為用FoxO1 siRNA轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞；過(guò)表達(dá)組為用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-FoxO1轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞。

1.2.2利用LPS刺激Ana-1細(xì)胞制作炎癥模型ELISA法檢測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α的濃度：將細(xì)胞鋪六孔板，按LPS濃度0、10、50、100、500、1 000 ng/mL加入培養(yǎng)基，刺激時(shí)間按16、24、36、48 h處理，收上清。相同標(biāo)本3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，在酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度值，根據(jù)ELISA軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本濃度。

1.2.3Real-Time PCR檢測(cè)FoxO1基因的變化：收集對(duì)照組和LPS組Ana-1細(xì)胞，加1 mL Trizol RNA提取試劑，提取Ana-1細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后使用大連Takara公司SYBR GREEN試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行下一步操作。

1.2.4Western雜交分析收集對(duì)照組和LPS組Ana-1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，在冰上放置2 h裂解細(xì)胞，離心機(jī)4℃12 000×g離心5 min，提取上清液用BCA法測(cè)蛋白含量。按30 ug蛋白經(jīng)煮沸10 min后，開(kāi)始10%SDS-PAGE凝膠電泳，隨后濕轉(zhuǎn)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜上。膜在5%脫脂奶粉中封閉，室溫1h。而后分別與不同一抗（1：1 000）孵育（anti-phospho-FoxO1、anti-FoxO1和GAPDH抗體），4℃搖床過(guò)夜，第二日PBST洗膜，15 min，洗3次，然后使用對(duì)應(yīng)的二抗雜交，室溫1 h，PBST洗膜3次后在，將PVDF膜放入凝膠成像儀內(nèi)，膜上滴ECL發(fā)光液，A液：B液= 1：1，30 s曝光。

1.2.5siRNA FoxO1轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染的前24 h在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)Ana-1細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量適中，用MEM稀釋好Lipo2 000和siRNA，將兩者輕輕搖晃至均勻，然后在室溫條件下孵育20 min使之形成siRNA-Lipo2 000混合液，添加到24 h前已經(jīng)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的Ana-1細(xì)胞中。36 h后收集細(xì)胞以及上清液，利用細(xì)胞做普通PCR檢測(cè)FoxO1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá)量，上清液做ELISA測(cè)炎癥因子的含量［4］。

1.2.6過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Fox-O1轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞Ana-1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟同上［5-6］。

1.3統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ELISA檢測(cè)炎癥因子IL-6、TNF-α的濃度

LPS濃度從0 ng/mL增加到50 ng/mL的時(shí)候，Ana-1細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6和TNF-α的含量逐漸升高。當(dāng)濃度為50 ng/mL時(shí)，此時(shí)炎癥因子的含量是最高的，炎癥因子IL-6、TNF-α的含量分別為1 124、2 241 ng/mL。從LPS加到100 ng/mL開(kāi)始，Ana-1細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、TNF-α的含量開(kāi)始緩慢降低趨于平穩(wěn)。當(dāng)LPS濃度固定在50 ng/mL，隨著時(shí)間的變化，炎癥因子的含量也在變化，從16 h炎癥因子的含量逐漸上升，到36 h達(dá)到高峰，然后緩慢下降。因此，LPS刺激巨噬細(xì)胞Ana-1的濃度為50 ng/mL，時(shí)間為36 h。見(jiàn)圖1。

圖1　不同濃度LPS以及時(shí)間下炎癥因子的濃度

2.2Real-Time PCR測(cè)得FoxO1 mRNA水平的含量變化

用Real-Time PCR方法檢測(cè)對(duì)照組Ana-1細(xì)胞以及LPS組Ana-1細(xì)胞中FoxO1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的含量表達(dá)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組Ana-1細(xì)胞相比，在LPS組中FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平的表達(dá)量下降，是對(duì)照組的0.36倍，因此差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明在LPS刺激會(huì)引起炎癥因子的含量的升高，同時(shí)引起FoxO1 mRNA水平的下降，可以推斷出炎癥反應(yīng)確實(shí)和FoxO1轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2　FoxO1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3Western Blotting測(cè)得FoxO1蛋白水平含量變化

Western Blotting結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞Ana-1磷酸化FoxO1蛋白在對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)量和LPS組細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但是FoxO1蛋白在LPS組的表達(dá)量是對(duì)照組的0.58倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。反映了FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在基因水平和蛋白水平的同步。見(jiàn)圖3。

圖3　western blot檢測(cè)FoxO1蛋白水平的表達(dá)

2.4Foxo1 siRNA轉(zhuǎn)染后測(cè)炎癥因子含量變化

Ana-1細(xì)胞進(jìn)行Foxo1 siRNA轉(zhuǎn)染后，用普通PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出炎癥因子的含量，轉(zhuǎn)染組相比于對(duì)照組，細(xì)胞炎癥因子TNF-α含量從782 ng/mL上升到1 290 ng/mL，IL-6的含量從161 ng/mL上升到251 ng/mL，炎癥因子含量顯著上升，此結(jié)果提示Foxo1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平在正常巨噬細(xì)胞中表達(dá)下降會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞分泌炎癥因子，因此可以推測(cè)FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在炎癥反應(yīng)過(guò)程中確實(shí)發(fā)揮很重要的作用。見(jiàn)圖4。

圖4　Foxo1 siRNA轉(zhuǎn)染后炎癥因子的含量

2.5脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)質(zhì)粒檢測(cè)炎癥因子含量

利用脂質(zhì)體2 000將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-FoxO1轉(zhuǎn)染進(jìn)入LPS組細(xì)胞中，普通PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染成功。ELISA檢測(cè)炎癥因子含量，過(guò)表達(dá)組Ana-1細(xì)胞相比于LPS組細(xì)胞，細(xì)胞炎癥因子TNF-α的含量從1 785 ng/mL下降到1 329 ng/mL，IL-6含量從486 ng/mL下降到317 ng/mL，炎癥因子含量顯著下降。此結(jié)果可以推測(cè)，過(guò)表達(dá)FoxO1可以抑制炎癥因子的釋放，對(duì)炎癥反應(yīng)起到抑制作用。見(jiàn)圖5。

圖5　過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后炎癥因子的含量

3　討論

炎癥是免疫反應(yīng)中的一個(gè)重要概念，指的是病原微生物或組織損傷引起的機(jī)體的局部和全身發(fā)生的一系列復(fù)雜的免疫應(yīng)答過(guò)程。急性炎癥反應(yīng)是機(jī)體自身防御感染以及修復(fù)損傷的保護(hù)性反應(yīng)，當(dāng)炎癥持續(xù)進(jìn)展變成慢性時(shí)，就會(huì)造成組織細(xì)胞的損傷，引發(fā)多種疾?。?］。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中巨噬細(xì)胞扮演著重要角色，它通過(guò)吞噬以及分泌多種炎癥因子對(duì)炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［8］。巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子中TNF-α、IL-6是比較經(jīng)典的炎性因子，它們的分泌進(jìn)一步導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、炎癥細(xì)胞的募集和粘附等，加重炎癥。如果能控制炎性因子的分泌，就能夠極大減輕炎癥反應(yīng)。

Fox（forkhead/winged helix transcription factor）基因家族具有高度保守的Forkhead結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄活化和轉(zhuǎn)錄抑制等功能。轉(zhuǎn)錄因子FoxO家族成員包括FoxO1、FoxO4、FoxO3a、FoxO6等。FoxO1在胞漿內(nèi)的存在形式為磷酸化的FoxO1，活化的Akt能夠使FoxO1發(fā)生磷酸化從核內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞漿，失去轉(zhuǎn)錄活性［9］。楊雙雙等［10］研究發(fā)現(xiàn)在小鼠肝臟結(jié)扎至肝膽管致纖維化的模型中，有關(guān)炎癥和增殖的Fox轉(zhuǎn)錄因子明顯下降，提示Fox轉(zhuǎn)錄因子有可能參與了肝臟炎癥以及肝臟纖維化的發(fā)生。羅丹［3］研究在膽汁淤積性肝纖維化的肝性炎癥中，應(yīng)用realtime PCR測(cè)出模型組小鼠肝組織FoxO1在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、3、7、14 d）mRNA水平的表達(dá)全部低于陰性對(duì)照組。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示也許FoxO1是炎癥過(guò)程中一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。因此該研究在細(xì)胞水平觀察FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的變化探討其與炎癥的關(guān)系。

本研究首先是制作炎癥模型，利用LPS刺激巨噬細(xì)胞Ana-1分泌促炎性細(xì)胞因子建立體外炎癥模型，雖然是體外模型，但是可以模擬體內(nèi)的炎癥反應(yīng)過(guò)程［11］。采用ELISA技術(shù)測(cè)出炎癥模型分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6的濃度，結(jié)果顯示：在LPS的濃度為50 ng/mL時(shí)巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子IL-6、TNF-α含量分別為2 190、1 124 ng/mL，干預(yù)時(shí)間為36 h時(shí)炎癥因子IL-6、TNF-α含量分別為2 190 ng/mL、1 995 ng/mL。此條件下炎癥因子含量最高，提示我們此時(shí)炎癥模型的效果最佳。其次應(yīng)用Real-Time PCR以及Western blotting檢測(cè)對(duì)照組Ana-1細(xì)胞和LPS組Ana-1細(xì)胞FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA以及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與對(duì)照組Ana-1細(xì)胞比較，F(xiàn)oxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平是對(duì)照組的0.36倍，蛋白水平是對(duì)照度的0.58倍，表達(dá)含量均下降（P＜0.05），提示FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)中有含量變化，可能參與炎癥反應(yīng)。最后觀察FoxO1 siRNA以及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-FoxO1轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞后炎癥因子的分泌量，結(jié)果顯示：siRNA下調(diào)Fox O1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的含量后，與對(duì)照組Ana-1細(xì)胞相比，干擾組Ana-1細(xì)胞分泌的炎癥因子TNF-α含量從782 ng/mL上升到1 290 ng/mL，IL-6的含量從161 ng/mL上升到251 ng/mL；過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-FoxO1轉(zhuǎn)染Ana-1細(xì)胞上調(diào)FoxO1轉(zhuǎn)錄因子mRNA水平的表達(dá)后，與LPS組細(xì)胞相比，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α的含量從1 785 ng/mL下降到1 329 ng/mL，IL-6含量從486 ng/mL下降到317 ng/mL。結(jié)果提示：FoxO1轉(zhuǎn)錄因子參與由巨噬細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)初步探討了在單一環(huán)境中巨噬細(xì)胞引起的炎癥改變FoxO1轉(zhuǎn)錄因子在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)以及兩者之間的關(guān)系，下一步我們將在動(dòng)物體內(nèi)觀察FoxO1轉(zhuǎn)錄因子是否具有同樣的功效，為臨床控制炎癥反應(yīng)提供初步的理論基礎(chǔ)。

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The Content Change Of FoxO1 Transcription Factor in Macrophages and the Relationship with Inflammation

ZHANG Na，ZHANG Zi-yan，ZHAO Ling-xia，YAO Yi，YANG Ying，ZHANG Jian-lin，ZHENG Guo-ping Basic medical，Shanxi Medical University，Taiyuan，Shanxi Province，030000 China

Objective Through study the content changes of FoxO1 transcription factor in the level of mRNA and protein in Macrophage as well as after the interference of the Foxo1 siRNA detective the content of inflammatory factors.From the perspective of inflammation progress to discuss the relationship between Foxo1 transcription factor and inflammation.Methods①Used LPS stimulate the Macrophage（Ana-1 cell）to product model of inflammation，then detected the inflammatory factor with ELISA.②Used Real-Time PCR、Western blotting to detect the content of FoxO1 transcription factor in level of mRNA and protein.③Used Lipo2 000 put FoxO1 siRNA in Ana-1 cell Media，We utilized ELISA to detect the concentration of the inflammation factor IL-6，TNF-α in control group and interference group.4. Used Lipo2 000 put FoxO1 over-expression plasmid in Ana-1 cell，We utilized ELISA to detect the concentration of the inflammation factor IL-6，TNF-α in LPS group and over-expression group.Results①Elisa test showed：when the concentration of LPS was 50 ng/mL，the content of inflammatory factor TNF-α、IL-6 is factor IL-6、TNF-α is 2 190、1 995 ng/mL.In this condition，the content of inflammatory factor was the maximum；②Real-Time PCR and Western blot test showed：The content of FoxO1 transcription factor in level of mRNA in the interference group was 0.36 times as much as the control group，the content of FoxO1 transcription factor in level of protein was 0.58 times as much as the control group；③Foxo1 siRNA interference test showed：compared with the control group，the interference group Ana-1cell secreted the content of inflammatory factors TNF-α was increased from 782 ng/mL to 1 290 ng/mL、IL-6 was increased from 161 ng/mL to 251 ng/mL；④Using Lipo 2 000 transfect the over-expreesion plasmid test showed：Compared with LPS group，the over-expression group Ana-1 cell secreted the content of inflammatory factors TNF-αwas dropped from 1 785 ng/mL to 1 329 ng/mL，IL-6 was dropped from 486 ng/mL to 317 ng/mL.Conclusion LPS stimulate the Ana-1 cell，then cause the inflammatory reaction，inducing the release of inflammation factor，meanwhile down-regulate the Foxo1 transcription factor in level of mRNA.Specific gene sliencing can up-regulate the release of inflammatory factors.Foxo1 transcription factor indeed participate in the progress of inflammatory reaction.

FoxO1 transcription factor；Macrophage；Inflammatory reaction

R36

A

2096-1782（2016）09－0001-06

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.09.001

2016-06-15）

張娜（1989.11-），女，陜西西安人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

鄭國(guó)平（1962.6-），男，澳大利亞人，博士，教授，研究方向：腎臟纖維化，E-mail：guoping.zheng@sydney.edu. au。