趙新星　張龍城　全超坤　韋干觀　桂源　楊志

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·基礎(chǔ)研究·

EB病毒BRLF1基因及EB病毒Rta/IgG抗體在鼻咽癌中表達(dá)的臨床意義

趙新星張龍城全超坤韋干觀桂源楊志＊

目的探討EB病毒BRLF1基因(EBV-BRLF1)表達(dá)量及血清EB病毒Rta/IgG(EBV-Rta/IgG)抗體濃度在鼻咽癌(NPC)早期診斷、臨床分期中的意義。方法運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)量89例NPC組織的EBV-BRLF1基因表達(dá)量，采用EBV-Rta/IgG定量抗體試劑盒檢測(cè)228例血清的Rta/IgG抗體濃度，分析它們與NPC早期診斷、臨床分期的相關(guān)性。228例血清包括NPC組89例、鼻咽部慢性黏膜炎病例(高危組)19例和同期健康人群120例。結(jié)果89例NPC組血清的EBV-Rta/IgG抗體濃度為(111.81±76.77)U/mL,靈敏度為75.3%(67/89)，特異度為94.2%(131/139)，診斷符合率為86.8%(198/228)；19例高危組血清的EBV-Rta/IgG抗體濃度為(15.14±33.04)U/mL,120例健康體檢組血清的EBV-Rta/IgG抗體濃度為(6.63±11.26)U/mL；各組間比較濃度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EBV-BRLF1基因在NPC腫瘤組織中的表達(dá)率為63.51%(47/74)，中位表達(dá)量為8.53。NPC組中EBV-BRLF1基因表達(dá)量與N分期、M分期及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)，與T分期差異有關(guān)(P=0.061)，接近臨界范圍。血清EBV-Rta/IgG抗體濃度與N分期、M分期及臨床分期無(wú)關(guān)(P>0.05)。在T分期組間比較中發(fā)現(xiàn)，T3期呈一定上升趨勢(shì)，T2與T3組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)。結(jié)論EBV-BRLF1基因在NPC組織中高度表達(dá)；EBV-Rta/IgG定量抗體試劑盒檢測(cè)可以作為早期篩查NPC的臨床指標(biāo)之一；EBV-BRLF1基因表達(dá)量及血清EBV-Rta/IgG抗體濃度與NPC的N分期、M分期及臨床分期無(wú)關(guān)，與T分期局部組織浸潤(rùn)呈一定相關(guān)性。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2016,16：243-247)

鼻咽癌；EB病毒BRLF1基因；EB病毒Rta/IgG抗體；臨床意義

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種源于鼻咽部上皮組織惡性程度較高的腫瘤。其最終診斷依賴于活檢組織病理，但對(duì)于一些早期及不典型的病例不一定能取到癌組織。因此，快速、方便、準(zhǔn)確的血清學(xué)檢測(cè)是早期有效發(fā)現(xiàn)NPC的一種方法。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)與NPC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，EBV立即早期基因BRLF1(EBV-BRLF1)的表達(dá)對(duì)病毒基因組具有反式激活作用，能夠引發(fā)裂解感染期基因“瀑布式表達(dá)”，誘導(dǎo)鼻咽部細(xì)胞發(fā)生癌變[1]。通過對(duì)EBV抗體譜的進(jìn)一步探索，國(guó)內(nèi)多數(shù)研究[2-5]表明，通過檢測(cè)血清中EBV特異性抗體Rta/IgG(EBV-Rta/IgG)可以為NPC早期篩查提供依據(jù)，有助于輔助NPC的早期診斷。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-Q-PCR)法檢測(cè)NPC患者鼻咽部腫瘤組織中BRLF1基因的表達(dá)量及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)定量檢測(cè)血清中EBV-Rta/IgG抗體的濃度，以探討其與NPC臨床參數(shù)間的關(guān)系及意義。

1　材料與方法

1.1材料收集2013年8月～2014年12月在我科就診疑似NPC患者的血清及鼻咽部組織樣本共108例。其中經(jīng)病理確診為非角化性未分化癌(NPC組)89例，男性68例、女性21例；年齡15～77歲，中位年齡48歲。所有病例均按“鼻咽癌2008 分期”[6]進(jìn)行分期，其中Ⅰ～Ⅱ期4例、Ⅲ期50例、Ⅳ期35例。經(jīng)病理確診為鼻咽部慢性黏膜炎病例(高危組)19例，男性13例、女性6例；年齡15～62歲，中位年齡36歲。同期健康人群體檢血清樣本(健康體檢組)120例，男性80例、女性40例；年齡25～67歲，中位年齡42歲。3組年齡、性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有樣本均得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，并在患者知情同意后獲得。血清樣本要求清亮、無(wú)沉淀，每份≥1 mL，在-20 ℃條件下凍存。用于檢測(cè)EBV-BRLF1基因mRNA的組織厚度≤0.5 cm，保存于RNAstore溶液中，-80 ℃條件下凍存。

1.2主要試劑及儀器Rta/IgG定量抗體檢測(cè)試劑盒由同昕生物技術(shù)(北京)有限公司提供，TIAN GEN牌 RNAstore、EBV-BRLF1及內(nèi)參基因EF1a引物由華大合成提供，總RNA提取液為QIAGEN公司的RNeasy Mini 試劑盒。酶標(biāo)儀(雙波長(zhǎng)450 nm/630 nm)，Gene Amp PCR System9700 擴(kuò)增儀(ABI 公司，美國(guó))，Nano Drop 2000超微量分光光度計(jì)，電泳槽，PCR Light Cycler 480 擴(kuò)增儀(Roche 公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法RT-Q-PCR：取凍存組織，經(jīng)溶解、研磨、分離、沉淀等處理后，使用Dnase I去除基因組DNA，參考RNeasy Mini 試劑盒說明書提取總RNA。根據(jù)NanoDrop 吸光度值提取約1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件:70 ℃變性，冰浴3 min，37 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋4倍進(jìn)行RT-Q-PCR檢測(cè)。目的基因及內(nèi)參基因在不同的反應(yīng)管中進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)測(cè)定基因做3次重復(fù)，反應(yīng)體系均為20 μL，反應(yīng)條件:95 ℃變性20 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；PCR Light Cycler 480 擴(kuò)增儀記錄各樣本達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù)(threshold cycle，Ct值)。假設(shè)2個(gè)樣本的內(nèi)參Ct值一樣，那么某個(gè)樣本的目的基因含量越高，其Ct值就越小，目的基因與內(nèi)參Ct值的差值越小。結(jié)果采用RT-Q-PCR中的相對(duì)定量法，即目的基因表達(dá)量=2- △△Ct法[7]計(jì)算?！鰿t值=(CtBRLF1RNA-CtEF1aRNA)，這個(gè)值代表目的基因的相對(duì)含量，△Ct Max為目的基因表達(dá)量最低，或內(nèi)參基因表達(dá)量相對(duì)最高；△△Ct=△Ct-△Ct Max，該值越小，目的基因表達(dá)越高；當(dāng)Ct值為35時(shí)，可以認(rèn)為該基因片段沒有表達(dá)。該法是RT-Q-PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因相對(duì)表達(dá)量的一種簡(jiǎn)便方法。

定量檢測(cè)Rta/IgG抗體濃度采用ELISA，按產(chǎn)品說明書操作規(guī)程進(jìn)行操作。將酶標(biāo)儀設(shè)定在雙波長(zhǎng)450 nm/630 nm，測(cè)量各孔吸光度值，用校準(zhǔn)品的含量及其對(duì)應(yīng)的吸光度值進(jìn)行l(wèi)og(X)-log(Y)直線回歸方程擬合，將待測(cè)樣品的吸光度值代入擬合曲線擬合方程，計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的濃度值。本實(shí)驗(yàn)試劑盒校準(zhǔn)品曲線的相關(guān)系數(shù)(r)為0.996 5，以30 U/mL為臨界值對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，變量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。血清Rta/IgG抗體濃度值在TNM分期、臨床分期組間關(guān)系分析采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)；BRLF1基因表達(dá)量在不同分期間關(guān)系分析采用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，2組之間比較采用Mann-Whitney 檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1BRLF1基因在NPC組和高危組中的表達(dá)情況NPC組中位數(shù)值明顯高于高危組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.221，P<0.05)；其中NPC組BRLF1基因的表達(dá)率為63.51%(47/74)；高危組Ct值為35的有15例，占93.75%(表1)。

表1　NPC組和高危組中BRLF1基因RT-Q-PCR表達(dá)情況

注：a示由于各種原因?qū)е虏糠纸M織樣本沒能提取出理想總RNA，以至于RT-Q-PCR未能進(jìn)行

2.2血清Rta/IgG抗體在不同組間的結(jié)果比較從表2可以看出，NPC組Rta/IgG平均濃度明顯高于高危組、健康體檢組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。89例NPC血清的Rta/IgG抗體表達(dá)陽(yáng)性67例，靈敏度為75.3%(67/89)，特異度為94.2%(131/139)，診斷符合率為86.8%(198/228)。

表2　血清Rta/IgG抗體在不同組間的結(jié)果

注：a示與高危組、健康體檢組比較，t值分別為-8.692，-12.823，P值均<0.05

2.3NPC患者BRLF1基因表達(dá)量及血清Rta/IgG抗體濃度與TNM分期、臨床分期的關(guān)系各組數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，BRLF1基因表達(dá)量呈偏態(tài)分布。NPC患者血清Rta/IgG抗體濃度、BRLF1基因表達(dá)量與TNM分期、臨床分期的關(guān)系見表3。

血清Rta/IgG抗體濃度在各N分期、M分期、臨床分期中的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.241，0.002，0.981，P=0.745，0.968，0.379)；T分期整體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.289，P=0.283)，但在T2與T3組間比較中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)。BRLF1基因表達(dá)量在各N分期、M分期、臨床分期中的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.184，0.068，4.748，P=0.336，0.795，0.093)；在T分期的關(guān)系比較中(χ2=6.998，P=0.061)，P值接近臨界范圍，提示基因表達(dá)量與T分期可能具有潛在的意義。

表3　 NPC患者BRLF1基因表達(dá)量、血清Rta/IgG抗體濃度與TNM分期、臨床分期的關(guān)系

3　討論

EBV是一種普遍存在于人體的皰疹病毒，感染后常形成終身潛伏期感染，進(jìn)入裂解期后與NPC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，BRLF1是EBV的立即早期基因，參與整個(gè)裂解感染的啟動(dòng)過程，作為一種反式激活因子調(diào)節(jié)EBV早、晚期裂解期基因組的復(fù)制和表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物Rta蛋白與EBV從潛伏期向裂解期的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。Rta蛋白可以在B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞中激活多種病毒基因的啟動(dòng)子,如BMLFI,BARFI,BALF5等[10]，能夠有效激活EBV進(jìn)入裂解復(fù)制狀態(tài)，對(duì)宿主腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有調(diào)控作用,對(duì)其發(fā)生、發(fā)展起到一定的影響。因此研究BRLF1基因及其產(chǎn)物Rta能為NPC的篩查和治療提供線索。目前尚鮮見關(guān)于NPC組織BRLF1基因的表達(dá)量及血清EBV-Rta/IgG抗體的濃度與NPC 2008臨床分期的報(bào)道。

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，在操作過程中易受污染而使假陽(yáng)性率偏高；RT-Q-PCR技術(shù)擁有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為分子生物學(xué)研究的重要工具[11-12]。本研究應(yīng)用RT-Q-PCR方法檢測(cè)74例NPC組及16例高危組鼻咽部組織BRLF1基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NPC組Ct<35的有47例，BRLF1基因表達(dá)率為63.51%(47/74)；高危組Ct=35的15例，另有1例為34.25；NPC組織中BRLF1基因中位表達(dá)量為8.53，而高危組為2.14，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明BRLF1基因在NPC組織中高度表達(dá)，且在NPC發(fā)生中起著重要作用。這與Feng等[13]運(yùn)用PT-PCR對(duì)鼻咽部活檢組織(NPC組和非NPC組)中的EBV早期裂解基因表達(dá)情況研究相一致。他們認(rèn)為，在NPC組和非NPC組中BZLF1、BALF2、BCLF1均能檢出，但只有BRLF1在NPC組織中檢測(cè)出，而正常組織中未能檢出。采用ELISA檢測(cè)血清Rta/IgG抗體和其他EBV抗體水平，分析比較各組血清抗體的靈敏度和特異度。國(guó)內(nèi)不少研究[2-5]認(rèn)為檢測(cè)血清Rta/IgG抗體是一項(xiàng)簡(jiǎn)單、可靠的方法，可用來早期篩選NPC患者。本次實(shí)驗(yàn)采用定量Rta/IgG抗體檢測(cè)試劑盒，通過測(cè)量各孔的吸光度值，根據(jù)校準(zhǔn)品擬合的直線回歸方程，計(jì)算出相對(duì)應(yīng)的濃度。從表2對(duì)228例患者血清中EBV-Rta/IgG抗體的濃度可得知，NPC組的濃度明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。唐國(guó)全等[14]以檢測(cè)血清樣本的相對(duì)吸光度值作為標(biāo)準(zhǔn)來判斷Rta/IgG抗體的診斷價(jià)值，其靈敏度為89.3%(134/150)，特異度為88.7%(133/150)。本次實(shí)驗(yàn)采用定量試劑盒檢測(cè)血清中Rta/IgG抗體濃度的靈敏度為75.3%，特異度為94.2%，診斷符合率為86.8%，結(jié)果與上述報(bào)告基本相近。具體不同可能與檢測(cè)試劑盒、檢測(cè)方法、陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)及樣本量的差異等有關(guān)。本研究通過評(píng)價(jià)Rta/IgG抗體定量試劑盒在NPC診斷中的作用，結(jié)果表明其在NPC的早期篩查、診斷中具有較高的敏感度、準(zhǔn)確度，有一定的臨床參考價(jià)值。

在分析血清Rta/IgG抗體水平與不同TNM分期及臨床分期的相關(guān)性研究中，蔡永林等[15]通過測(cè)量NPC患者血清Rta/IgG抗體相對(duì)吸光度值，認(rèn)為EBV-Rta/IgG表達(dá)與NPC 92′分期無(wú)關(guān)，其研究用樣本數(shù)量有限，且未能測(cè)得具體濃度值，能否對(duì)NPC臨床分期進(jìn)行相關(guān)指導(dǎo)，可靠性尚不能確認(rèn)。本文的表3具體分析NPC病例中BRLF1基因表達(dá)量及Rta/IgG抗體的濃度與NPC分期是否存在一定的關(guān)系，通過對(duì)比各組間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在N分期、M分期、臨床分期中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在T分期的相關(guān)性比較中，發(fā)現(xiàn)BRLF1基因表達(dá)量P值接近臨界范圍(P=0.061)，Rta/IgG抗體的濃度值在T2與T3組間比較,T3濃度較T2高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.048)，提示上述檢測(cè)值與NPC的周圍浸潤(rùn)情況T分期可能呈一定的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期增加，EBV-BRLF1基因表達(dá)量的四分位距有下降趨勢(shì)，可能是BRLF1作為一種EBV的立即早期基因，參與病毒基因組的早期表達(dá)，其反式激活作用，引發(fā)病毒裂解感染期基因“瀑布式表達(dá)”，誘導(dǎo)鼻咽部細(xì)胞發(fā)生癌變。Rta蛋白為溶解期抗原，在EBV由潛伏期向裂解期轉(zhuǎn)換的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)腫瘤經(jīng)過T2期發(fā)展階段后,EBV-BRLF1表達(dá)及Rta抗原相對(duì)增多，浸潤(rùn)范圍擴(kuò)大，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移同步發(fā)生，可以刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更多的抗體，使得Rta/IgG抗體值有一定程度的上升。隨著病情進(jìn)一步發(fā)展到T4階段，EBV-BRLF1表達(dá)量相對(duì)恒定及其抑制體內(nèi)IRF3、IRF7轉(zhuǎn)錄和抑制干擾素-β誘導(dǎo)，逃避宿主天然免疫應(yīng)答[16]，機(jī)體處于免疫極低狀態(tài)，免疫細(xì)胞間的原動(dòng)態(tài)平衡被打破，新平衡建立，使得Rta/IgG抗體濃度值相對(duì)穩(wěn)定。這可能是導(dǎo)致NPC患者血清Rta/IgG抗體濃度在不同T分期中呈現(xiàn)相應(yīng)改變的原因，具體的機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，定量檢測(cè)血清Rta/IgG抗體濃度在NPC早期篩查、診斷中具有較高的臨床價(jià)值。NPC組織EBV-BFLF1基因表達(dá)量及血清Rta/IgG抗體濃度，在不同N分期、M分期、臨床分期中大致相同；在T3期呈一定的上升趨勢(shì)，提示EBV-BFLF1基因及其產(chǎn)物在NPC的局部組織浸潤(rùn)中起到特定的作用，為進(jìn)一步探索NPC發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移提供參考價(jià)值。

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(本文編輯楊美琴)

Clinical significance of EBV-BRLF1 gene and EBV-Rta/IgG antibody expression in nasopharyngeal carcinoma

ZHAOXin-xing,ZHANGLong-cheng,QUANChao-kun,WEIGan-guan,GUIYuan,YANGZhi＊.

DepartmentofOtolaryngology,People’sLibrationArmy303Hospital,Nanning530021，ChinaCorresponding author： ZHAO Long-cheng, Email: zhlc_303@163.com

ObjectiveTo explore the significance of Epstein-Barr virus BRLF1 (EBV-BRLF1) gene expression and serum EBV-Rta/IgG antibody concentration on early diagnosis and clinical staging of nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsReal-time quantitative polymerase chain reaction(RT-Q-PCR) was used to measure the EBV-BRLF1 gene expression of 89 NPC tissues, and quantitative EBV-Rta/IgG antibody kit was used to detect the serum Rta/IgG antibody concentration of 228 clinical samples. The correlation between the NPC early diagnosis and clinical stages was analyzed. The serum samples included 89 NCP, 19 cases with chronic nasophayngeal mucosal inflammation and 120 healthy people.ResultsThe mean value of EBV-Rta/IgG concentration in 89 NPC patients was (111.81±76.77)U/mL, with a sensitivity of 75.3%(67/89)and specificity of 94.2% (131/139) and diagnosis coincidence rate of 86.8%(198/228); The mean value of EBV-Rta/IgG concentration in 19 high risk group and 120 healthy volunteers were (15.14±33.04) U/mL and (6.63±11.26) U/mL; There were significant difference between NPC and other groups(P<0.05).EBV-BRLF1 gene expression rate in NPC tumor tissue was 63.51%(47/74),with median amount was 8.53. No significant difference in EBV-BRLF1 gene expression level was found in the NPC patients in different N, M or clinical stages (P>0.05) while the difference in T stage (P=0.061) was near to the critical range. No significant difference in EBV-Rta/IgG antibody concentration was found in the NPC patients in different N, M or clinical stages (P>0.05). But in comparison among T stages, it was found that T3 rise by a certain trend and the difference between T3 and T2 groups was statistically significant (P=0.048).ConclusionsEBV-BRLF1 was highly expressed in NPC tumor tissues; Quantitative EBV-Rta/IgG antibody kits can be used as a clinical indicator of early screening for NPC； The expression of EBV-BRLF1 gene and concentration of serum EBV-Rta/IgG antibody were not associated with N, M or clinical stages, but had a certain correlation with the T staging concerning local tissue invasion.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol, 2016,16: 243-247)

Nasopharyngeal carcinoma; Epstein-Barr virus BRLF1 gene; Epstein-Barr virus Rta/IgG antibody; Clinical significance

中國(guó)人民解放軍第三○三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科南寧530021；＊中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)研究中心北京100193

張龍城(Email：zhlc_303@163.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2016.04.004

2015-08-25)