王蘇雨，王敏，姚迪，盧春，陸衛(wèi)平

(1南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇淮安223300；2南京醫(yī)科大學)

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·基礎研究·

轉(zhuǎn)染lncRNA Gm15638的小鼠腎小球系膜細胞中FN、Col Ⅰ表達變化

王蘇雨1，王敏1，姚迪1，盧春2，陸衛(wèi)平1

(1南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇淮安223300；2南京醫(yī)科大學)

目的觀察轉(zhuǎn)染長鏈非編碼RNA(lncRNA)Gm15638的小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES13中纖維化標志物纖維連接蛋白(FN)和Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)的表達變化。方法 采用PCR法擴增lncRNA Gm15638片段，并將其插入pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體，構建重組慢病毒載體pCDH-Gm15638。用轉(zhuǎn)染試劑將重組目的質(zhì)粒pCDH-Gm15638與包裝質(zhì)粒psPAX2和包膜質(zhì)粒pMD2.G共同轉(zhuǎn)染293T細胞，收集重組慢病毒懸液，測定病毒滴度。將SV40-MES13細胞分為實驗組和對照組，分別轉(zhuǎn)染pCDH-Gm15638和慢病毒空載體pCDH-Mock。轉(zhuǎn)染48 h后采用real-time PCR法檢測Gm15638驗證pCDH-Gm15638轉(zhuǎn)染情況；提取細胞總蛋白，采用Western blotting法檢測FN、Col Ⅰ。結果 雙酶切鑒定和測序結果顯示，重組慢病毒載體pCDH-Gm15638構建成功。通過三質(zhì)粒包裝獲得重組慢病毒，測得病毒滴度約6×107efu/mL。實驗組、對照組細胞中Gm15638相對表達量分別為867、1，兩組相比，P<0.05。實驗組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.739、1.08，對照組分別為0.48、0.845，兩組相比，P均<0.05。結論 轉(zhuǎn)染Gm15638的SV40-MES13細胞中纖維化標志物FN、Col Ⅰ表達水平下調(diào)。

長鏈非編碼RNA；腎小球系膜細胞；纖維連接蛋白；Ⅰ型膠原蛋白；糖尿病腎病

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中[1～4]。目前研究表明lncRNA參與細胞周期、細胞凋亡、細胞代謝等活動，并廣泛參與機體生理和病理過程，是多種疾病診斷及治療潛在的靶點[5]，但關于lncRNA與糖尿病腎病關系的研究較少。糖尿病腎病是糖尿病的嚴重并發(fā)癥，糖尿病腎病早期病理改變?yōu)槟I臟增大，隨后有系膜細胞增生、系膜基質(zhì)增多、腎小球基底膜增厚，最后可出現(xiàn)腎小球硬化[6]。糖尿病腎病的發(fā)生機制十分復雜[7,8]。本課題組前期通過lncRNA芯片對糖尿病腎病小鼠和正常小鼠的腎組織進行檢查，發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病小鼠腎組織中l(wèi)ncRNA Gm15638表達明顯下調(diào)。為進一步探討Gm15638在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，本實驗構建了表達Gm15638的重組慢病毒載體并轉(zhuǎn)染小鼠腎小球系膜細胞，觀察細胞中纖維化標志物纖維邊接蛋白(FN)和Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)的表達變化，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料慢病毒表達系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP三種質(zhì)粒構成，所用的小鼠腎小球系膜細胞SV40-MES13及293T細胞均在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別生長在含有5%、10%滅活胎牛血清的DMEM中，均加入青霉素和鏈霉素。相關PCR引物由南京銳真科技有限公司合成；PCR酶、限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ、BamH Ⅰ與SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa公司；T4連接酶購自南京諾唯贊科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、切膠純化試劑盒購自美國Omega公司；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；增強化學發(fā)光試劑購自美國Cell Signaling Technology公司；抗FN單克隆抗體、抗Col Ⅰ單克隆抗體、抗Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。

1.2重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638的構建及鑒定根據(jù)Ensembl的基因序列，分別設計Gm15638序列的上下游引物，PCR擴增出Gm15638序列全長，核酸電泳驗證PCR產(chǎn)物并切膠回收。用限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP和Gm15638的PCR擴增產(chǎn)物，酶切產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳切膠回收，回收產(chǎn)物與載體pCDH連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞大腸埃希菌DH5α，隨機挑選氨芐西林抗性的單克隆進行大量擴增，提取出重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638進行雙酶切鑒定、基因測序。用LipofectamineTM2000將包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜質(zhì)粒pMD2.G與目的質(zhì)粒pCDH-Gm15638共同轉(zhuǎn)染入293T細胞，同時以慢病毒空載體(pCDH-Mock)作陰性對照。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察到有大約90%的細胞出現(xiàn)明顯綠色熒光，收集含病毒顆粒的細胞上清液，離心并過濾病毒液。通過熒光計數(shù)法測定病毒滴度。

1.3重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638轉(zhuǎn)染SV40-MES13細胞用pCDH-Gm15638和pCDH-Mock分別轉(zhuǎn)染SV40-MES13細胞(分別為實驗組與對照組)，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。分別提取RNA并用real-time PCR法檢測Gm15638，以β-actin為內(nèi)參，反應條件：95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共40個循環(huán)。

1.4SV40-MES13中FN、Col Ⅰ檢測分別提取實驗組和對照組細胞總蛋白，采用Western blotting法檢測FN、Col Ⅰ，以Tubulin蛋白為內(nèi)參。用Image J圖像分析系統(tǒng)軟件計算條帶灰度值，代表蛋白相對表達量。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1Gm15638質(zhì)粒的構建及鑒定結果構建pCDH-Gm15638質(zhì)粒后進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在7 742 bp和489 bp處出現(xiàn)2條特異性條帶(圖1)，說明長為489 bp的基因已成功克隆至慢病毒載體中。質(zhì)粒送測序后經(jīng)軟件比對，插入的489 bp片段與Ensembl基因庫中序列一致，表明重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638構建成功。將包膜質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2與目的質(zhì)粒pCDH-Gm15638共同轉(zhuǎn)染293T細胞，以轉(zhuǎn)染pCDH-Mock的293T細胞作陰性對照，病毒滴度分別1×108、6×107efu/mL。

2.2重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638轉(zhuǎn)染SV40-MES13細胞情況兩組轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光表達，陽性率為80%。實驗組與對照組細胞中Gm15638相對表達量分別為867、1，兩組相比，P<0.05。

2.3轉(zhuǎn)染pCDH-Gm15638后SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達比較實驗組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.739、1.08，對照組細胞中FN、Col Ⅰ相對表達量分別為0.48、0.845，兩組相比，P均<0.05。見圖2。

注：M為DNA標準參照物；1為Gm15638質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物;2為重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638的雙酶切產(chǎn)物。

圖1重組質(zhì)粒pCDH-Gm15638的雙酶切鑒定結果

圖2　轉(zhuǎn)染pCDH-Gm15638后SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達比較

3　討論

非編碼RNA(ncRNA)是不被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA的統(tǒng)稱，根據(jù)其功能分為持家ncRNA和調(diào)控ncRNA，持家ncRNA主要包含tRNA、rRNA、核內(nèi)小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)，調(diào)控ncRNA包含lnc RNA和短鏈非編碼RNA[9]。lncRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，包括內(nèi)含子、基因間轉(zhuǎn)錄本及雙向重疊的轉(zhuǎn)錄本，廣泛參與機體生理和病理過程。lncRNA可從表觀遺傳學、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等參與基因的調(diào)控。目前，lncRNA的研究還主要集中在其表達差異的檢測，明確功能的lncRNA相對較少，對其作用機制的研究尚處于起步階段。

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥中最為嚴重的一種，如治療不及時，可導致終末期腎小球病變、腎衰竭，造成腎臟不可逆性損傷[10]。該病發(fā)病機制十分復雜，高血糖引起的代謝通路異常、多元醇代謝通路、氧化應激、晚期糖基化終末產(chǎn)物增多、炎癥介質(zhì)水平增高等都可能是其發(fā)病原因，但具體機制尚未完全闡明，治療效果也并不理想[15]。糖尿病腎病的典型病理變化是腎小球硬化，組織學特點是基底膜增厚、細胞外基質(zhì)堆積和腎小管基質(zhì)纖維化，而基底膜主要是由膠原、非膠原糖蛋白和蛋白多糖構成，因此，纖維化和膠原蛋白增多可能是糖尿病腎病發(fā)生的重要因素[11,12]。

新近研究表明，ncRNA通過異常表達、甲基化、基因多態(tài)性等多種途徑在糖尿病的發(fā)病過程中起重要作用[16]。Alvarez等[17]研究表明，高糖狀態(tài)下LncRNA-PVTI能上調(diào)腎系膜細胞中纖溶酶原激活物抑制因子和轉(zhuǎn)化因子的表達，從而導致腎小球中細胞外基質(zhì)積聚，F(xiàn)N-1水平增高。有學者[18]發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL可通過抑制胰島素依賴性蛋白激酶抑制因子2B的表達，引起P15INK4B基因低表達而導致糖尿病。Ravassard等[19]發(fā)現(xiàn)，HI-LNC25是一種胰島特異性lncRNA，能夠調(diào)控與糖尿病發(fā)生相關的蛋白編碼基因如GLIS家族鋅指3(GLIS3)的表達。糖尿病是導致動脈粥樣硬化的危險因素，Wu等[20]研究顯示，lincRNA-p21可通過調(diào)控p53信號轉(zhuǎn)導通路抑制血管平滑肌細胞和巨噬細胞的增殖、誘導凋亡，從而減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。

Gm15638屬于基因間lncRNA，定位于4號染色體。本實驗成功構建了Gm15638表達質(zhì)粒，成功構建了慢病毒，并轉(zhuǎn)染SV40-MES13細胞，發(fā)現(xiàn)SV40-MES13細胞中FN、Col Ⅰ表達下調(diào)，提示上調(diào)Gm15638表達可能有助于降低腎小球系膜細胞纖維化指標水平，延緩纖維化。我們猜測，Gm15638可能通過調(diào)控下游靶蛋白等途徑發(fā)揮作用，具體的調(diào)控機制仍有待進一步研究。

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江蘇省衛(wèi)生廳科研項目(H201458)。

陸衛(wèi)平(E-mail: hyhalwp@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.008

R692.6

A

1002-266X(2016)31-0028-03

2016-05-12)