王凱，連海峰，牛瓊，賈興芳，劉成霞

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256600)

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胃癌組織中雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ、神經(jīng)纖毛蛋白2的表達變化及其意義

王凱，連海峰，牛瓊，賈興芳，劉成霞

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256600)

目的觀察胃癌組織中雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ(COUP-TFⅡ)和神經(jīng)纖毛蛋白2(NRP2)的表達變化，并分析COUP-TFⅡ、NRP2表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 收集手術(shù)切除的新鮮胃癌組織及其癌旁正常胃黏膜組織各60例，采用Western blotting法和免疫組化法檢測胃癌組織及正常胃黏膜組織中的COUP-TFⅡ、NRP2，分析COUP-TFⅡ、NRP2表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率分別為70.0%、78.3%，正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率分別為30.0%、21.7%。胃癌組織、正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ相對表達量分別為0.84±0.22、0.68±0.34，NRP2相對表達量分別為0.86±0.17、0.58±0.22，胃癌組織中COUP -TFⅡ、NRP2相對表達量均高于正常胃黏膜組織(P均<0.05)。胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2表達呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.263，P<0.05)。浸潤深度為T3、T4的胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率高于浸潤深度T1、T2的胃癌組織(P均<0.05)；中低分化胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率高于高分化胃癌組織(P均<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中COUP -TFⅡ、NRP2陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P均<0.05)。結(jié)論 COUP-TFⅡ、NRP2在胃癌組織中高表達，并與胃癌的浸潤深度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者可能協(xié)同參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

胃腫瘤；胃癌；雞卵清蛋白基因；雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ；神經(jīng)纖毛蛋白2

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，治療效果不佳，患者預后差。盡管胃癌的治療手段不斷更新，但中晚期胃癌患者病死率仍較高[1，2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移導致的胃癌復發(fā)及進展期胃癌對放化療的耐受仍是臨床醫(yī)生面臨的難題[3,4]。很多學者認為淋巴管的新生與胃癌轉(zhuǎn)移及預后有密切關(guān)系，與淋巴管新生的有關(guān)因子有望作為胃癌轉(zhuǎn)移的標志物，同時也是胃癌的治療靶點。Lin等[5]發(fā)現(xiàn)，雞卵清蛋白上游啟動子轉(zhuǎn)錄因子 Ⅱ(COUP-TF Ⅱ)可通過上調(diào)NRP2表達促進胚胎時期的新生淋巴管形成，在乳腺癌鼠模型中，沉默COUP-TF Ⅱ表達可抑制淋巴管新生，提示該基因在淋巴管新生中起重要作用。既往研究[6]表明NRP2在胃癌組織中表達升高，并能促進癌旁淋巴管的新生，但其機制尚不明確，我們推測COUP-TF Ⅱ可能通過調(diào)控NRP2表達促進胃癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。為此，本研究觀察了觀察胃癌組織中COUP-TF Ⅱ和NRP2的表達變化，并探討其意義，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料收集濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院2015年3～8月手術(shù)切除的胃癌組織及其對應癌旁組織各60例份，放入-80 ℃冰箱保存。胃癌患者中，男36例、女24例，年齡35～76歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)放、化療治療，癌旁組織為正常胃黏膜上皮組織。小鼠抗人COUP-TFⅡ單克隆抗體，兔抗人NRP2多克隆抗體，BCA蛋白濃度測定試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，兔抗人GAPDH多克隆抗體，HRP標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗，免疫組化二抗PV-6001。

1.2COUP-TFⅡ、NRP2檢測分別采用Western blotting法和免疫組化法檢測胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織中的COUP-TFⅡ、NRP2。

1.2.1Western blotting法檢測COUP-TFⅡ、NRP2 稱量胃癌組織及癌旁正常胃黏膜組織各50 mg，提取總蛋白，測定蛋白濃度。各取70 μg總蛋白，加入上樣緩沖液，加入8%的SDS-聚丙烯酰氨凝膠小孔進行電泳。電泳條件為80 V恒壓。電泳后以300 mA恒流轉(zhuǎn)膜(冰上)，其中內(nèi)參GAPDH及COUP-TFⅡ轉(zhuǎn)膜時間為90 min，NRP2轉(zhuǎn)膜時間為170 min。轉(zhuǎn)膜完成后用TBST洗5 min×2次。條帶于7%脫脂奶粉封閉4 h，加入一抗4 ℃過夜。37 ℃復溫0.5 h，回收一抗，TBST洗膜10 min×3次。將膜放入二抗孵育盒搖床上緩慢孵育80 min。TBST洗膜15 min×3次，用ECL發(fā)光液曝光。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.2.2免疫組化法檢測COUP-TFⅡ、NRP2 新鮮標本組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，脫水、浸蠟、包埋，做4 μm厚切片，60 ℃恒溫箱中烘烤30 min，進行脫蠟和水化，PBS洗2次、每次5 min。以pH 8.0的EDTA進行抗原修復，降火13 min，冷卻至室溫。自來水洗5 min，PBS洗2次。3%H2O2浸泡室溫15 min。自來水洗5 min，PBS洗2次。滴加一抗，4 ℃過夜，復溫20 min。自來水洗10 min，PBS洗2次。加二抗，37 ℃下30 min。自來水洗5 min，PBS洗2次。滴加DAB顯色劑顯色，自來水終止，流水沖洗5 min。滴加新鮮過濾的蘇木素，染色3 min，流水充分沖洗。鹽酸酒精中分化5 s，流水沖洗。碳酸鋰中返藍5 s，流水充分沖洗。脫水、透明，封片晾干。以細胞核或細胞質(zhì)呈棕黃色為目的蛋白表達陽性，根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比判定結(jié)果。染色強度為無著色計0分、淡黃色計1分、棕黃色計2分、棕褐色計3分；每張切片在400倍光鏡下觀察5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞百分比≤25%計1分、>25%～50%計2分、>50%～75%計3分，>75%計4分；上述兩項得分相乘，≥4為蛋白表達陽性。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1胃癌組織及正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ、NRP2表達比較胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率分別為70.0%、78.3%，正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率分別為30.0%、21.7%,見圖1。胃癌組織、正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ相對表達量分別為0.84±0.22、0.68±0.34，NRP2相對表達量分別為0.86±0.17、0.58±0.22，胃癌組織中COUP -TFⅡ、NRP2相對表達量均高于正常胃黏膜組織(P均<0.05)，見圖2。胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2表達呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.263，P<0.05)。

圖1　胃癌組織及正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ、NRP2表達比較(免疫組化法)

注：T為腫瘤組織，N為正常胃黏膜組織。

圖2胃癌組織及正常胃黏膜組織中COUP-TFⅡ、NRP2表達(Western blotting檢測)

2.2COUP-TFⅡ、NRP2表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系浸潤深度為T3、T4的胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率高于浸潤深度T1、T2的胃癌組織(P均<0.05)；中低分化胃癌組織中COUP-TFⅡ、NRP2陽性表達率高于高分化胃癌組織(P均<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中COUP -TFⅡ、NRP2陽性表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織(P均<0.05)。詳見表1。

3　討論

胃癌的轉(zhuǎn)移包括四種方式，分別是直接蔓延、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和腹腔內(nèi)種植。其中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌擴散的主要途徑，也是早期轉(zhuǎn)移的主要方式。胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程，多個因子參與其調(diào)控。血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)3是首個被發(fā)現(xiàn)的淋巴管特異性生長因子受體。胃癌細胞以自分泌或旁分泌形式分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C與VEGF-D，這兩個因子能與VEGFR3特異性結(jié)合，促進淋巴管新生，其中VEGF-C在淋巴管新生和遷移中扮演重要角色[7]。Karpanen等[8]發(fā)現(xiàn)NRP2在VEGFC誘導的淋巴管內(nèi)皮細胞遷移和淋巴管新生中有重要作用，尤其是能夠促進腫瘤淋巴管新生。 Favier等[9]發(fā)現(xiàn)敲除NRP2的小鼠表現(xiàn)為小淋巴管和毛細淋巴管缺失，充分證實了NRP2在淋巴管生成中的作用。除此之外，NRP2還能增強VEGF-C與VEGFR3的結(jié)合能力，而沉默NRP2表達可抑制腫瘤淋巴管新生，并抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[10]。Lin等[5]證實COUP-TFⅡ參與調(diào)節(jié)NRP2的表達，因此我們推測COUP-TFⅡ可能為NRP2的上游調(diào)節(jié)因子，并與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

表1　COUP-TFⅡ、NRP2表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：與T1、T2浸潤深度相比，*P<0.05；與高分化者相比，#P<0.05；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，△P<0.05。

COUP-TFⅡ是孤核受體，屬于核受體蛋白中的類固醇/甲狀腺激素受體超家族。COUP-TFⅡ可調(diào)節(jié)基因表達、個體發(fā)育、細胞分化及內(nèi)穩(wěn)態(tài)。COUP-TFⅡ還能調(diào)節(jié)其他核受體的活性，包括雌激素受體、維甲酸受體、甲狀腺激素受體、過氧化物酶增殖子激活受體等與細胞增殖和分化有關(guān)的受體[11～13]。 Qin等[14]發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤微環(huán)境中COUP-TFⅡ的表達可抑制腫瘤新生淋巴管的形成。Polvani等[15]發(fā)現(xiàn)胰腺癌中COUP-TFⅡ高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處侵襲有關(guān)，是胰腺癌的不良預后因子。Qin等[16，17]證實COUP-TFⅡ能通過調(diào)控VEGF/VEGFR2信號通路影響胰腺癌的血管新生；COUP-TFⅡ還可對抗TGF-β誘導的生長阻滯，促進前列腺癌發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤復發(fā)和預后不良有關(guān)。Nagasaki等[18]發(fā)現(xiàn)COUP-TFⅡ與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學分級和雌激素受體狀態(tài)有關(guān)，是乳腺癌的不良預后因子。研究[19]證實COUP-TFⅡ可通過NF-κB通路來影響乳腺癌的侵襲能力。Navab等[20]通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，使之高表達COUP-TFⅡ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細胞侵襲性明顯增強，其機制可能與調(diào)控MMP-2表達有關(guān)。目前對于COUP-TFⅡ在腫瘤細胞血管生成、淋巴管生成及腫瘤細胞侵襲等方面的作用機制尚未完全明確。我們的前期研究已證明NRP2在胃癌發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色。我們希望通過研究COUP-TFⅡ與NRP2的關(guān)系，探索COUP-TFⅡ的相關(guān)作用通路。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中COUP-TFⅡ及NRP2表達高于正常胃黏膜組織，二者表達呈正相關(guān)關(guān)系；COUP-TFⅡ、NRP2表達與胃癌的浸潤深度、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示COUP-TFⅡ和NRP2在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)已證實COUP-TFⅡ可調(diào)節(jié)NRP2的表達，我們推測NRP2可能為COUP-TFⅡ的下游因子，二者通過共同調(diào)節(jié)新生淋巴管形成，參與了胃癌的進展。關(guān)于COUP-TFⅡ?qū)RP2的調(diào)節(jié)是直接調(diào)控還是間接調(diào)控及其具體機制尚需進一步探索。

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Expression chaneges of COUP-TFⅡ and NRP2 in human gastric carcinoma tissues

WANGKai,LIANHaifeng,NIUQiong,JIAXingfang,LIUChengxia

(AffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

ObjectiveTo observe the expression changes of chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ (COUP-TFⅡ) and Neuropilin-2 (NRP2) in human gastric carcinoma (GC) tissues and analyze the relationship between their expression and clinicopathological features. Methods Paired tumorous and adjacent non-tumorous human gastric tissues were obtained from 60 patients with GC who underwent surgical resection. We detected the expression of COUP-TF Ⅱand NRP2 by Western blotting and immunohistochemistry. In addition, the relationship between the expression of COUP-TF Ⅱand NRP2 and clinicopathological features was analyzed. ResultsThe positive expression rates of COUP-TFⅡand NRP2 in the GC tissues were 70.0% and 78.3%, in the normal gastric mucosa tissues were 30% and 21.7%, respectively. The relative expression of COUP-TFⅡ in the GC tissues and normal gastric mucosa tissues was 0.84 ± 0.22 and 0.68±0.34, and the relative expression of NRP2 was 0.86±0.17 and 0.58±0.22, respectively. The expression of COUP-TFⅡ and NRP2 in the GC tissues was both higher than that of the normal gastric mucosa tissues (allP<0.05). Moreover, COUP-TFⅡand NRP2 expression was positively correlated with each other (r= 0.263,P<0.05). GC tissues of metastasis at T3, T4stage had higher expression of COUP-TFⅡand NRP2 compared to T1and T2stage (allP<0.05). COUP-TFⅡand NRP2 in moderate and poorly differentiated GC tissues showed higher positive expression rate compared to that in high differentiated GC tissues (allP<0.05). The positive expression rates of COUP-TF II and NRP2 in GC tissues with lymph node metastasis were significantly higher than those in the tissues with no lymph node metastasis (allP<0.05). ConclusionsCOUP-TF Ⅱ and NRP2 is highly expressed in GC tissues and is related to depth of tumor invasion, differentiated grade and lymph node metastasis. As a result, COUP-TF Ⅱand NRP2 may be involved in the tumorigenesis and development synergistically.

Gastric carcinoma; gastric cancer; chicken oralbumin gene; chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor Ⅱ; Nearopilin-2

山東省自然科學基金資助項目(ZR2014HQ072)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0490)；濱州市科技發(fā)展計劃項目(2014ZC0116)。

王凱(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向為胃腸道腫瘤。E-mail： xsdfwkk@163.com

簡介：劉成霞(1965-)，女，醫(yī)學博士，教授，主要研究方向為胃腸道腫瘤。E-mail： phdlcx@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.31.003

R735.2

A

1002-266X(2016)31-0008-04

2016-05-27)