陳　俊，張國富

1.崇陽縣人民醫(yī)院口腔科(湖北 咸寧 437500) 2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科(湖北 宜昌 443000)

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CDK2AP1在口腔白斑中的表達(dá)水平研究

陳俊1，張國富2*

1.崇陽縣人民醫(yī)院口腔科(湖北 咸寧 437500) 2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科(湖北 宜昌 443000)

目的研究細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2關(guān)聯(lián)蛋白1(CDK2AP1)在口腔白斑中的表達(dá)。方法采用免疫組化二步法(S-P)檢測10例人正常口腔粘膜，22例口腔白斑組織中CDK2AP1蛋白的表達(dá)，收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果CDK2AP1蛋白在口腔白斑組織的陽性率(23.71%±7.93%)明顯低于正?？谇徽衬そM織(63.88%±11.72%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論CDK2AP1在口腔粘膜中的表達(dá)水平隨著口腔病變惡性程度增高而降低，本指標(biāo)對口腔病變惡性程度的研究有一定臨床意義。

CDK2AP1；口腔白斑； 免疫組化二步法

近年來，隨著生活環(huán)境、生活習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)等的變化，口腔白斑呈年輕化趨勢，發(fā)病率明顯上升?？谇话装呤强谇徽衬ぶ凶畛Ｒ姷陌┣安∽僛1]，研究表明4%～6%[2]的口腔白斑可惡變?yōu)榭谇击[狀細(xì)胞癌。由于口腔癌前病變病因復(fù)雜，其發(fā)生與多種癌基因有關(guān)。本研究擬通過對口腔白斑的檢測，探討細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2關(guān)聯(lián)蛋白1(cyclin-dependent kinase 2-associ-atedprotein 1,CDK2AP1)蛋白在口腔白斑中的表達(dá)，為臨床的早期診斷提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本選擇選取湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科2015年9月—2016年3月臨床和病理資料齊全的22例口腔粘膜白斑組織標(biāo)本，所有患者術(shù)前均未接受任何治療，術(shù)后均由病理科確診。另選取10例正?？谇徽衬そM織作為對照組。

1.2主要試劑鼠抗人抗體CDK2AP1購自上海博英生物有限公司；免疫組化二步法(S-P)檢測試劑盒、即用型SABC試劑盒、酶底物DAB顯色劑均購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法新鮮組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成5 μm切片，行免疫組化染色：①載玻片浸泡于濃硫酸重鉻酸鉀洗液24 h去污后多聚賴氨酸稀釋液浸泡24 h，行防脫片處理，干燥箱烘烤50 min;②烤片機(jī)60℃烤4 h;③二甲苯100%，95%，80%的酒精常規(guī)脫蠟，水化;④3%雙氧水中浸泡10 min,PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;⑤抗原熱修復(fù)：放入盛有檸檬酸鹽緩沖液的高壓鍋中加熱至沸騰2 min，室溫下放置至冷卻;⑥增加一抗(Bcl-2與p53為工作液),4℃冰箱孵育過夜,PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min;⑦滴加試劑1，室溫孵育20 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;⑧滴加試劑2，室溫孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;⑨DAB顯色：室溫反應(yīng)，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來水沖洗終止反應(yīng);⑩蘇木素復(fù)染，使胞核著色，脫水、透明、中性樹脂封片。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn)CDK2AP1蛋白呈棕黃色顆粒大部分表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)。結(jié)果評估在高倍鏡下進(jìn)行，方法參照Campo等[3]標(biāo)準(zhǔn)綜合計(jì)分。0分為基本不著色，弱著色記1分，中度著色記2分，強(qiáng)著色記3分；陽性細(xì)胞數(shù)所占比例為4個(gè)等級：0%～5%為0分，6%～25%為1分，25%～50%為2分，50%以上為3分。最后以陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度計(jì)分之和所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定：0分為(-)；1、2分為弱陽性(+)；3、4分為中等陽性(++)；5分以上為強(qiáng)陽性(+++)。

2　結(jié)果

CDK2AP1蛋白陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿內(nèi)。CDK2AP1蛋白在人正?？谇徽衬そM織中陽性細(xì)胞數(shù)分散在上皮基底層；在口腔粘膜白斑組織中隨著上皮異常增生程度增加而減少(見圖1)。正常口腔粘膜組織中CDK2AP1平均陽性率為(63.88%±11.72%)，口腔白斑上皮細(xì)胞平均陽性率(23.71%±7.93%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

3　討論

CDK2AP1是在倉鼠口腔癌模型研究中最先被Todd等發(fā)現(xiàn)[4]。在人類基因組中CDK2AP1位于12q24，全長1.6 kb,編碼115個(gè)氨基酸序列[5-6]。CDK2AP1在細(xì)胞各周期的調(diào)控過程中起到很大作用，可以讓各種信號在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行傳遞，通過整合匯集到細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖。在細(xì)胞增殖過程中，依賴性激酶CDK4C能和Gi/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控因子CDK2AP1發(fā)生特異性結(jié)合，進(jìn)一步讓S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄啟動，從而加劇G期細(xì)胞進(jìn)入S期，最終讓細(xì)胞增殖失去控制[7-8]。由此可見口腔黏膜組織的病變發(fā)生與細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂關(guān)系密切，細(xì)胞周期的調(diào)控因子發(fā)生異常變化可以導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)失控性生長，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[9-10]。

A:正?？谇徽衬?B:口腔粘膜白斑組織。 圖1　CDK2AP1蛋白的表達(dá)(S-P二步法，×400)

樣本編號口腔正常粘膜口腔白斑樣本編號口腔正常粘膜口腔白斑176.5324.3412-24.22269.6622.3113-22.12388.2132.2314-32.23459.2314.5615-13.56563.2234.3316-32.33658.019.3517-8.25762.9922.2718-21.37861.0126.6419-27.54950.1232.1520-23.151049.8830.0921-20.0911-34.1922-14.34

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用S-P二步法檢測CDK2AP1蛋白在正?？谇徽衬そM織、口腔白斑中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示正?？谇徽衬ど掀ぶ屑?xì)胞平均陽性率明顯高于白斑組(P<0.05)，說明CDK2AP1在口腔粘膜組織惡變的初始階段就已經(jīng)參與并起到一定的作用。在以后的研究中，可進(jìn)一步研究在口腔白斑到口腔癌的發(fā)生發(fā)展中CDK2AP1的表達(dá)水平的變化及相互關(guān)系，判斷CDK2AP1蛋白與口腔的惡變程度的相關(guān)性。

[1]周曾同,馮安心.口腔粘膜病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2012:88-89.

[2]Choi S,Myers J.Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma:implications for therapy[J].Journal of dental research，2008，87(1):14-32.

[3]Campo E,Merino MJ,Liotta L,et al.Disrtribition of the 72-kd Type IVCollagenase Innonneo-plastic and neoplastic thyroid tissue[J].Human pathol,1992,23(12):1 395-1 401.

[4]高楠,姜睿,羅樹立,等.CDK2AP1與腫瘤[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(1):156-158.

[5]Leyre Bento,Gabriela Rodriguez Macias,Pascual Balsalo-bre,et al.Role of Bcl-2 Immunohistochemical Expression As An Independent Biological Prognostic Marker At Diagnosis of Classical Hodgkin's Lymphoma[J].Blood(ASHAnnual Meeting Abstracts),2011,11(8):4 859.

[6]Yukiharu Hiyoshi,Masayuki Watanabe，Koutaro Hirashima,et al.CDK2AP1 is associated with tumor progressionand a poor prognosis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncology Reports,2009,22(5):35-39.

[7]Shintani ML.Novel tumor growth inhibitionmechanism by cell cycle regulator cdk2apl involves oral cancer[J].Microvasc Research, 2010,80(15):324-331.

[8]Buajeeba W, Zhang X,Ohyana H,et al.Interaction of die CDK2 associated protein-1,p12DOC-1-CDK2AP1,with its hanolog p14DOC-1R[J].B iochan B iophys Res Carmmn,2004,315(4):998-1 003.

[9]王聽.細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生的研究[J].中國民康醫(yī)學(xué),2010,22(16):2 135-2 136.

[10] Olga Zolochevska,Marxa L,Figueiredo.Expression of cell cycle regulator cdk2apl suppresses turner cell phenotype by non-cell-autonomou smechan inismso[J].OralO-Ncologyo,2009(45):106-112.

責(zé)任編輯：艾茜

Study on the Expressions of CDK2AP1 in Oral Leukoplakia

Chen Jun1,Zhang Guofu2*

(1.DepartmentofStomatology,thePeople′sHospitalofChongyang,Xianning437500,China;2.DepartmentofStomatology,theAffiliatedHospitalofHubeiThreeGorgesVocationalandTechnicalCollege,Yichang443000,China)

Objective To explore the expressions of cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1 (CDK2AP1) in oral leukoplakia.Methods The immunohistochemical two-step (S-P) technique was used to detect the expressions of CDK2AP1 protein in 10 cases of normal oral mucosa and 22 cases of oral leukoplakia tissue.Results The positive rate of CDK2AP1 protein in oral leukoplakia and normal oral mucosa were 23.71%±7.93% and 63.88%±11.72%.There was statistical difference (P<0.05).Conclusion The expression level of CDK2AP1 in the oral mucosa was decreased with the increase of the malignant degree of the oral cavity, which has a certain clinical significance in the study of the malignant degree of oral lesions.

CDK2AP1;oral leukoplakia;lmmunohistochemical two-step

陳俊(1979- ) ，男，湖北咸寧人，主治醫(yī)師 ，研究方向：口腔頜面部腫瘤手術(shù)治療;*

張國富，男，碩士研究生，講師，主治醫(yī)師，主要從事抗凋亡基因和抑癌基因致癌機(jī)制等方面的研究。

R781.59

A

1008-8164(2016)03-0011-02

2016-05-19