張淼，劉繡華，趙紅宇

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.河南大學(xué)河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣東省口腔醫(yī)院南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院）

木犀草素對(duì)人牙周膜細(xì)胞增殖及成骨分化能力的影響

張淼1，劉繡華2，趙紅宇3*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000；2.河南大學(xué)河南省天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣東省口腔醫(yī)院南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院）

目的：探討不同濃度木犀草素對(duì)人牙周膜細(xì)胞（PDLC）增殖及成骨分化能力的影響。方法：體外培養(yǎng)PDLC并進(jìn)行組織來(lái)源鑒定，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT四唑鹽比色法、堿性磷酸酶（ALP）檢測(cè)試劑盒、Q-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因等方法觀察不同濃度木犀草素對(duì)PDLC增殖及成骨分化能力的影響。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示不同濃度的木犀草素可以促進(jìn)PDLC增殖，ALP試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明木犀草素也可以促進(jìn)PDLC的ALP活性，且濃度為1 μmol/L的ALP OD值最高。Q-PCR結(jié)果顯示木犀草素可以上調(diào)PDLC內(nèi)ALP及成骨轉(zhuǎn)錄因子mRNA的含量。結(jié)論：一定濃度的木犀草素對(duì)PDLC增殖及成骨分化能力有一定的促進(jìn)作用，為未來(lái)木犀草素應(yīng)用于臨床治療牙周疾病提供依據(jù)。

木犀草素；人牙周膜細(xì)胞；增殖；堿性磷酸酶；RUNX2基因

［Abstract］Objective：To evaluate the biological effects of Luteolinl on the proliferation and differentiation in human periodontal ligament cells（PDLC）.Methods：MTT，ALP kit and Q-PCR was used to detect the expression of osteogenesis related gene. Results：Luteolinl（100，10，1，0.1，0.01 μ mol/L）could increase the proliferation of PDLC，and there were significant differences compared with control group（P＜0.05）.The ALP Kit results showed that Luteolinl could increase the ALP actiuty of PDLC（P＜0.05）.The Q-PCR results showed that Luteolin could increase the expression of ALP and RUNX2（P＜0.05）. Conclution：At proper concentration，Luteolinl can increase the proliferation and differentiation of PDLC.

［Key words］Luteolinl；human periodontal ligament cell；proliferation；ALP；RUNX2

牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cell，PDLC）具有多向分化的潛能，可分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞，在一定的培養(yǎng)條件下可以形成骨結(jié)節(jié)，并表達(dá)骨相關(guān)蛋白，如堿性磷酸酶（ALP）、骨涎蛋白、骨鈣素等［1-4］，在牙周組織的更新和再生方面起著重要的作用。木犀草素具有抑制腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、降低破骨細(xì)胞活性等藥理活性［5-7］，Choi等［8］報(bào)道木犀草素可以促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1 ALP及骨鈣素的增加，但木犀草素對(duì)PDLC的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外培養(yǎng)PDLC，觀察木犀草素作用于PDLC后細(xì)胞增殖及成骨分化能力的變化。

1　材料和方法

1.1主要試劑DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)，Gibco），胎牛血清（FBS）（美國(guó)，Sigma），木犀草素（河南大學(xué)劉繡華教授惠贈(zèng)），ALP試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.2人PDLC體外培養(yǎng)取因正畸需要而拔出的新鮮恒牙，于無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)用刀片刮取牙根中1/3牙周膜組織，充分剪碎后以一定間隔平鋪于6孔板，上置蓋玻片，加入1～2 ml DMEM培養(yǎng)液（10%FBS，1%雙抗），置于飽和濕度、5%二氧化碳、37℃環(huán)境下，每3 d換液一次，直至細(xì)胞從組織塊中游離出并長(zhǎng)滿。胰酶消化傳代，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3木犀草素對(duì)PDLC增殖的影響將生長(zhǎng)狀況良好的第3代PDLC以2×l03個(gè)/ml接種于3塊96孔培養(yǎng)板，每塊96孔板分6組，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔200 μl，周邊孔填充無(wú)菌PBS液。將3塊96孔板放在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入不同培養(yǎng)液（100、10、1、0.1、0.01 μmol/L）200 μl，在24、48、72 h分別取一塊培養(yǎng)板每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去上清，每孔加二甲基亞颯（DMSO）200 μl，在振蕩器上緩慢震蕩10 min使結(jié)晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處測(cè)定每孔吸光度值（A490），取各孔均值，以A490數(shù)值反映活細(xì)胞數(shù)目。

1.4木犀草素對(duì)PDLC ALP活性的影響取生長(zhǎng)狀況良好的第3～5代PDLC，以5×104個(gè)/ml的濃度鋪于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁，按分組分別加入含不同濃度木犀草素（100、10、1、0.1、0.01 μmol/L）的礦化誘導(dǎo)液［DMEM培養(yǎng)基（10%FBS），地塞米松10-7mol/L，抗壞血酸Vc 50 μg/ml，β-甘油磷酸鈉10 mmol/L］200 μl，5%CO2、37℃培養(yǎng)72 h后，按ALP試劑盒說(shuō)明書操作，酶標(biāo)儀520 nm處測(cè)OD值。

1.5Q-PCR檢測(cè)木犀草素作用于PDLC后成骨相關(guān)基因的表達(dá)（1）將含100、10、1、0.1、0.01 μmol/L木犀草素的礦化誘導(dǎo)液分別培養(yǎng)PDLC 72 h后Trizol提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，PCR引物設(shè)計(jì)：從Genbank中查找人ALP及RUNX2基因序列，RT-PCR實(shí)驗(yàn)由廣州必思恩生物科技有限公司完成。RT-PCR引物序列：Hom-ALP-F：5'-CCCC CGAGTCGGACGTGTAC-3'；Hom-ALP-R：5'-CCGC CATGGACTTTCGTCAC-3'；Hom-RUNX2-F：5'-GAG ATTTGTGGGCCGGAGTG-3'；Hom-RUNX2-R：5'-CCTAAATCACTGAGGCGGTC-3'；GAPDH-h-209-F：5'-AACGGATTTGGTCGTATTGG-3'；GAPDH-h-209-R：5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。（2）檢測(cè)指標(biāo)：讀取Ct（Cytle threshold）值，參照文獻(xiàn)報(bào)道的比較閾值法［1］，利用2-△△Ct進(jìn)行計(jì)算。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件，進(jìn)行多樣本間的方差分析及兩兩間的LSD檢驗(yàn)，Q-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PDLC的培養(yǎng)及篩選所選擇的細(xì)胞大部分呈長(zhǎng)梭形，胞體飽滿，具有細(xì)而長(zhǎng)的胞突，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央、呈圓形或卵圓形。少量細(xì)胞較小且形態(tài)不規(guī)則。10～15 d后細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀鋪滿培養(yǎng)板。見(jiàn)圖1。

圖1　PDLC的形態(tài)（×40）

2.2不同濃度木犀草素對(duì)PDLC增殖的影響在24、48、72 h時(shí)，各濃度木犀草素均可促進(jìn)PDLC的增殖（P＜0.05），經(jīng)多樣本均數(shù)間兩兩比較顯示在24 h、48 h、72 h時(shí)各濃度組同一時(shí)間點(diǎn)間PDLC的增殖比較差異意義無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.3不同濃度木犀草素對(duì)PDLC的ALP活性的影響各濃度木犀草素均可促進(jìn)ALP活性（P＜0.05），經(jīng)多樣本均數(shù)間兩兩比較顯示100 μmol/L濃度組木犀草素對(duì)PDLC中ALP活性的促進(jìn)與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），100 μmol/L濃度組較其他實(shí)驗(yàn)組的ALP活性降低，其余各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1　木犀草素對(duì)PDLC增殖的影響（OD值）（A490，±s，n=6）

表1　木犀草素對(duì)PDLC增殖的影響（OD值）（A490，±s，n=6）

注：與空白組比較，1）P＜0.05

72 h 0.541±0.0461）0.389±0.0741）0.415±0.0321）0.377±0.0991）0.417±0.0471）0.183±0.008組別100 μmol/L 10 μmol/L 1 μmol/L 0.1 μmol/L 0.01 μmol/L空白組24 h 0.364±0.0331）0.284±0.0731）0.306±0.0791）0.262±0.0211）0.280±0.0251）0.125±0.019 48 h 0.330±0.0961）0.362±0.0281）0.377±0.0211）0.365±0.0231）0.393±0.0611）0.144±0.028

表2　木犀草素作用于PDLC 72 h后ALP平均光密度值（OD值）

2.4Q-PCR檢測(cè)木犀草素作用的PDLC中骨相關(guān)基因ALP、RUNX2的表達(dá)ALP表達(dá)變化為：木犀草素作用72 h后，與空白組比較，除0.01 μmol/L組外，實(shí)驗(yàn)組ALP表達(dá)均呈上調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），1 μmol/L組ALP表達(dá)上調(diào)明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），見(jiàn)表3。RUNX2表達(dá)變化為：木犀草素作用于PDLP 72 h后，1、0.1 μmol/L組較空白組RUNX2表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他濃度組RUNX2表達(dá)較空白組上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3　木犀草素誘導(dǎo)PDLC 72 h后ALP及RUNX2的相對(duì)表達(dá)量

3　討論

牙周膜是圍繞牙根并連接牙根與牙槽骨的致密結(jié)締組織，含有多種細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDLC群在一定條件下具有多向分化能力［9］，在牙周組織的改建和修復(fù)過(guò)程中起著重要作用［10］。木犀草素又名黃色黃素或黃示靈，是一種天然四羥基黃酮化合物，分子式：C15H10O6，分子量：286.23。最初因從木犀草的葉、莖、枝中分離得到而得名，可從多種天然藥材、蔬菜果實(shí)中分離得到，如金銀花、荊芥、芹菜、卷心菜、裸花紫珠、西蘭花、蘋果皮、菊花、胡蘿卜、胡椒和洋蔥的葉子等［5］，在自然界中常以糖基化的形式存在［6］。木犀草素具有多種藥理活性，富含木犀草素的植物常被用作中藥治療疾病。而且木犀草素還具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及降低破骨細(xì)胞活性等作用［5-7］。張毅等［11］將木犀草素用于脂多糖（LPS）干擾下的小鼠單核巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木犀草素抑制促炎因子PGE2等的表達(dá)，且在RNA水平抑制了COX-2的表達(dá)，說(shuō)明木犀草素的抗炎作用可能與抑制PGE2和COX-2的表達(dá)有關(guān)。但是木犀草素對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞骨分化的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木犀草素濃度在0.01～100 μmol/L，明顯促進(jìn)人PDLC增殖，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

ALP是一種非特異性磷酸單酯酶，在人體內(nèi)大量存在，能夠反映細(xì)胞成骨活性，是早期成骨細(xì)胞分化的標(biāo)志［12］。無(wú)論是新鮮正常牙周組織，還是體外培養(yǎng)的PDLC，都具有較高的ALP活性（比牙齦組織或細(xì)胞高數(shù)倍至十幾倍）［13-14］。組織化學(xué)研究表明，牙槽骨、成骨細(xì)胞、牙周韌帶ALP染色強(qiáng)陽(yáng)性［8］。這表明PDLC具有較強(qiáng)的成骨傾向。ALP活性檢測(cè)已成為PDLC成骨分化功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，木犀草素可促進(jìn)PDLC對(duì)ALP活性的表達(dá)，說(shuō)明木犀草素具有促進(jìn)PDLC向可以形成礦化組織的細(xì)胞即成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨分化細(xì)胞分化的作用。但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究探索。在本研究中，應(yīng)用ALP試劑盒檢測(cè)不同濃度木犀草素作用于PDLC后ALP活性的變化，結(jié)果顯示：各濃度木犀草素作用于PDLC 72 h后均可促進(jìn)ALP活性的增加（P＜0.05），Q-PCR檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)各濃度的木犀草素可以使ALP表達(dá)上調(diào)（除0.01 μmol/L濃度木犀草素）（P＜0.05），且0.1 μmol/L濃度木犀草素對(duì)PDLC中ALP活性的促進(jìn)與其他實(shí)驗(yàn)組相比顯著增加（P＜0.05）。說(shuō)明一定濃度的木犀草素可以促進(jìn)PDLC的成骨分化，增強(qiáng)ALP活性。

RUNX2基因是一種成骨細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞早期增殖的過(guò)程中起著重要的作用［15］，是檢測(cè)PDLC骨向分化的常用指標(biāo)之一［16-17］。Q-PCR結(jié)果顯示：各濃度木犀草素在礦化誘導(dǎo)條件下均可上調(diào)RUNX2基因的表達(dá)，其中1 μmol/L組和0.1 μmol/L組RUNX2基因的表達(dá)上調(diào)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。上述結(jié)果說(shuō)明一定濃度的木犀草素可以提高PDLC成骨細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，提示木犀草素可以促進(jìn)PDLC成骨分化。

綜上所述，一定濃度（0.01～100 μmol/L）的木犀草素在一定條件下可以促進(jìn)PDLC的增殖、蛋白合成及成骨分化，為以后的研究提供一定的基礎(chǔ)。

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Effects of Luteolinl on the Proliferation and Differentiation in Human Periodontal Ligament Cells

ZHANG Miao1，LIU Xiuhua2，ZHAO Hongyu3*
（1.Department of Stomatology，The Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital，Urumgi 830000，China；2.Key Laboratory of Natural Medicine and Immunology，Henan University；3.Guangdong Provincial Stomatological Hospital）

R781

A

1008-2344（2016）05-0340-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.006

2016-03-28

（吳迪 編輯）

趙紅宇（1965—），女（漢），主任醫(yī)師，研究方向：牙周病與全身性疾病的關(guān)系.zhongyu93@163.com