殷世亮，張弘，金戈，王俊平，周凡

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院藥理學教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院生理學教研室；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科）

高三尖杉酯堿與伊馬替尼協(xié)同誘導慢性粒細胞凋亡

殷世亮1，張弘2*，金戈1，王俊平1，周凡3

（1.沈陽醫(yī)學院基礎醫(yī)學院藥理學教研室，遼寧沈陽110034；2.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院生理學教研室；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院血液科）

目的：考察高三尖杉酯堿（HHT）與伊馬替尼（STI571）對人慢性粒細胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）細胞株KU812細胞的凋亡誘導作用。方法：采用AO-EB熒光染色法及PI染色的流式細胞術，考察HHT和STI571分別和聯合給藥對KU812細胞的凋亡誘導作用；采用Western blot技術考察HHT和STI571對KU812細胞凋亡相關蛋白的影響。結果：HHT能夠與STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡，且兩者的協(xié)同誘導作用呈時間及劑量依賴效應；能顯著引起PARP蛋白裂解，并顯著下調Bcl-XL蛋白的表達水平。結論：HHT與STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡，具有協(xié)同抗CML作用。

高三尖杉酯堿；伊馬替尼；細胞凋亡；慢性粒細胞

［Abstract］Objective：To investigate the apoptotic induction effects of homoharringtonine（HHT）combined with imatinib（STI571）on human chronic myeloid leukemia（CML）KU812 cells.Methods：KU812 cells were treated with HHT or/and STI571.Total cell numbers were counted by using hemocytometer.Apoptotic cells were determined by using fluorescence microscope and FACS after staining with AO-EB and PI respectively.The cleavage of poly ADP-ribose polymerase（PARP）and the expression of anti-apoptotic proteins were determined by Western blot.Results：HHT could prompt the apoptotic induction of imatinib in KU812 cells，which was in a time and dose dependent manner.Apoptosis induced by HHT and imatinib was correlated with the down-regulation of Bcl-XL and the cleavage of PARP.Conclusion：HHT prompt apoptotic induction of imatinb in KU812 cells and the combination of HHT with imatinib will provide a more effective strategy for the clinical treatment of CML.

［Key words］homoharringtonine；imatinib；apoptosis；CML

高三尖杉酯堿（homoharringtonine，HHT）是從紅豆杉科三尖杉屬三尖杉（Cephalotaxus fortumei Hook f.）的枝葉、種子、樹皮和根部分離出的具有抗腫瘤活性的生物堿［1-3］。HHT和它的類似物能夠抑制蛋白質和DNA的合成。甲磺酸伊馬替尼（STI571）是基于人慢性粒細胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）特異表達的融合蛋白BCR/ABL的酪氨酸激酶活性位點設計合成的小分子化合物，2001年經美國FDA批準上市，用于治療慢性期CML。臨床報道表明，STI571耐藥的CML細胞對HHT仍然敏感［4-5］。本研究將HHT和BCR/ABL蛋白的小分子抑制劑STI571聯合，考察HHT與STI571對CML細胞的凋亡誘導作用，以期為CML的臨床治療提供更為有效的治療方案。

1　材料與方法

1.1材料人CML細胞株KU812（美國ATCC公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；碘化丙啶（PI）、丫啶橙（AO）、溴化乙啶（EB）（美國Sigma公司）；Western blot抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；鼠抗PARP和鼠抗Mcl-1單克隆抗體（美國Cell-Signaling公司）；化學增強發(fā)光試劑盒（英國Amersham Biosciences公司）。

1.2細胞培養(yǎng)人CML細胞株KU812細胞均培養(yǎng)于含有100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、1 mmol/L谷氨酰胺及10%（v/v）經加熱滅活的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。所有實驗用細胞均于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3AO-EB雙染法進行凋亡細胞形態(tài)學觀察取對數生長期細胞，以每孔1×105/ml的細胞密度接種于24孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液。藥物作用后，取1 ml細胞懸液，3 000 r/min離心1 min，棄上清液，重懸于50 μl磷酸鹽緩沖液（PBS）中，然后加入AO/EB等體積混合液5 μl（100 μg/ml AO，100 μg/ml EB），混勻。取12 μl混合液點于潔凈載玻片上，用蓋玻片封片，在熒光顯微鏡490 nm波長下記錄并觀察細胞的染色情況和形態(tài)學改變。細胞呈現AO著色的綠色熒光同時EB拒染，并出現核皺縮、邊緣化、發(fā)芽、發(fā)泡以及凋亡小體等典型凋亡形態(tài)的細胞被認為是早期凋亡細胞。細胞若呈現EB著色的紅色熒光，說明細胞已經死亡，為壞死細胞或晚期凋亡細胞。

1.4細胞PI染色的流式細胞術檢測經藥物處理相應時間后離心收集細胞（2×106個），經PBS洗滌后用300 μl PBS重懸細胞，加入20 ml冰預冷的70%乙醇中固定12 h后收集樣品。離心收集細胞，于800 μg/ml的RNase溶液中37℃孵育20 min后，加入PI染色液。待測樣品DNA含量采用流式細胞術檢測，檢測激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為625 nm?？v坐標代表細胞數量，橫坐標代表熒光強度即DNA含量。樣品經流式細胞術檢測采集10 000個細胞。所得數據采用CELLQuest軟件（Becton Dickinson）進行處理分析。

1.5Western blot檢測研究表明，HHT可以誘導CML細胞的凋亡并下調Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平，發(fā)揮誘導細胞凋亡作用［3］，因此應用Western blot法檢測了HHT和STI571分別及聯合處理KU812細胞后Bcl-XL的蛋白水平，以及細胞凋亡指示蛋白PARP（poly-（ADP-ribose）-polymerase）的活化情況。凋亡相關蛋白細胞總蛋白（300 μg）通過RIPA裂解緩沖液［60 mmol/L Tris鹽酸，180 mmol/L氯化鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS），1%NP-40，0.6%脫氧膽酸鈉，1 mmol/L PMSF，200 μmol/L leupeptin和3 μg/ml aprotinin，pH 8.0］裂解得到。應用Bradford蛋白定量法定量蛋白，通過SDS-凝膠電泳法分離蛋白，采用Bio-Rad電轉儀將蛋白濕轉到

PVDF膜上。采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后，加入20 ml稀釋濃度的待測蛋白特異性單克隆抗體，于4℃結合12 h。TBST洗滌3次后與標記的二抗室溫結合1 h后TBST洗滌1次，PVDF膜經化學發(fā)光試劑（ECL kit，Amersham Biosciences）處理5 min，PVDF膜與富士膠片于曝光板中壓片曝光，經顯影液和定影液處理后掃描采集圖像。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數±標準差表示。多組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HHT與STI571聯合給藥誘導KU812細胞凋亡的形態(tài)學觀察通過AO-EB染色的熒光顯微鏡觀察HHT和STI571分別給藥以及聯合給藥對KU812細胞的凋亡誘導作用。0.2 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨處理KU812細胞24 h，均不能誘導細胞凋亡；聯合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細胞24 h，可觀察到顯著的細胞凋亡形態(tài)圖，HHT能夠協(xié)同STI571誘導KU812細胞凋亡，見圖1。

2.2HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的時間依賴性關系分別將0.1 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571單獨以及聯合處理KU812細胞12、24、48 h，及培養(yǎng)12、24、48 h的KU812細胞作為對照組，采用AO-EB染色的細胞形態(tài)學計數法，結果顯示，單獨給予0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571處理KU812細胞12、24、48 h，誘導KU812細胞凋亡無明顯的的時間依賴關系；1 μmol/L STI571聯合0.1 μmol/L HHT處理細胞12、24、48 h，分別有20%、47%、86%細胞凋亡，可見HHT與STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡具有顯著的時間依賴關系，見圖2。

2.3HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的劑量依賴性關系分別將不同濃度HHT和STI571單獨以及聯合處理KU812細胞24 h，采用AO-EB染色的細胞形態(tài)學計數法，結果顯示，單獨給予0.1、0.2 μmol/L HHT或單獨給予1、2 μmol/L STI571處理KU812細胞24 h，誘導KU812細胞凋亡均無明顯的劑量依賴關系；1 μmol/L STI571聯合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細胞24 h，分別有42%和66%細胞凋亡，2 μmol/L STI571聯合0.1、0.2 μmol/L HHT處理細胞48 h，分別有72%和87%細胞凋亡，HHT與STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡具有顯著的劑量依賴關系，見圖3。

圖1　HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的細胞形態(tài)學觀察（×400）

圖2　HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的時間依賴性關系

圖3　HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的劑量依賴性關系

2.4HHT與STI571聯合給藥誘導KU812細胞凋亡的流式細胞術檢測0.1 μmol/L HHT或1 μmol/L STI571單獨處理KU812細胞24 h，PI染色的流式細胞術結果表明，分別有8.5%和4.9%的細胞發(fā)生凋亡，未出現顯著的凋亡誘導作用。0.1 μmol/L HHT和1 μmol/LSTI571聯合處理KU812細胞24 h，采用PI染色的流式細胞術可以檢測到顯著的SubG1凋亡峰，約42%的KU812細胞發(fā)生凋亡，見圖4。

2.5HHT與STI571聯合給藥對KU812細胞凋亡相關蛋白的影響分別給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細胞24 h，并不顯著改變抗凋亡蛋白Bcl-XL的表達水平，聯合給予0.2 μmol/L HHT和1 μmol/L STI571處理KU812細胞24 h，可以顯著下調Bcl-XL蛋白的表達水平，并協(xié)同活化PARP凋亡指示蛋白，見圖5。

圖4　HHT聯合STI571協(xié)同誘導KU812細胞凋亡的流式細胞術檢測

圖5　HHT聯合STI571對KU812細胞凋亡相關蛋白的影響

3　討論

近年來的臨床研究顯示，STI571不能完全根除CML惡性克隆，并已出現了嚴重的耐藥性，據報道，對STI571耐藥的CML細胞對HHT仍然敏感，并且HHT對帶有T315I BCR/ABL酪氨酸激酶點突變的STI571耐藥細胞仍然有治療效果［6-7］。因此將HHT與STI571聯合給予CML患者將會取得良好的治療效果，并克服腫瘤的耐藥。

本實驗中HHT聯合STI571協(xié)同誘導CML細胞系KU812細胞凋亡，并呈良好的時間依賴和劑量依賴關系。0.1和0.2 μmol/L HHT處理KU812細胞24、48 h不能夠誘導細胞凋亡的發(fā)生，同樣單獨給予1和2 μmol/L STI571處理KU812細胞24、48 h也不能夠誘導細胞凋亡的發(fā)生，但將兩者聯合給藥可顯著地誘導KU812細胞凋亡。本研究結果表明，HHT與STI571聯合能夠顯著誘導CML細胞系KU812凋亡，二者具有協(xié)同抗CML作用。

HHT聯合STI571可以顯著地引起KU812細胞Bcl-XL的表達下調，并伴隨著凋亡標準性蛋白PARP的裂解活化。Bcl-XL為Bcl-2家族中重要凋亡抑制蛋白，Bcl-XL的下調表達可以引起腫瘤細胞的凋亡［8］。本研究提示HHT可能通過下調Bcl-XL抗凋亡蛋白發(fā)揮協(xié)同STI571誘導細胞凋亡的抗CML作用。

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Homoharringtonine Prompt Apoptotic Induction of Imatinib in CML Cells

YIN Shiliang1，ZHANG Hong2*，JIN Ge1，WANG Junping1，ZHOU Fan3
（1.Department of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Department of Physiology，School of Life Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University；3.Shenyang Military General Hospital）

R965

A

1008-2344（2016）05-0332-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.05.004

2016-03-16

（文敏 編輯）

沈陽醫(yī)學院優(yōu)秀人才項目（No.20123045）；遼寧省教育廳一般項目（No.L2013402）

殷世亮（1980—），男（漢），博士，講師，研究方向：抗腫瘤藥物作用機制研究.E-mail：yslal@163.com

張弘（1981—），女（漢），博士，講師，研究方向：抗腫瘤藥物作用機制研究.E-mail：song0688@sina.com