饒金鵬　邱　楓　劉　青　蔡益婷　金　敏　金　帆

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江杭州310052；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江杭州310006

溫度、凍存液體積和操作時(shí)間對(duì)小鼠卵子Cryotop玻璃化凍融復(fù)蘇率的影響

饒金鵬1邱楓1劉青1蔡益婷1金敏1金帆2

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江杭州310052；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江杭州310006

目的探討Cryotop法中冷凍操作環(huán)境溫度、加載覆蓋的保護(hù)液微滴體積以及投入液氮前暴露于高濃度冷凍保護(hù)劑（CPA）的時(shí)間對(duì)小鼠MⅡ期卵子玻璃化凍融效果的影響。方法對(duì)6周齡KM系小鼠促排卵、脫顆粒細(xì)胞以獲得形態(tài)良好的MⅡ期卵子，用Cryotop法對(duì)其進(jìn)行玻璃化凍融，卵母細(xì)胞隨機(jī)分組后實(shí)驗(yàn)方案如下：根據(jù)冷凍環(huán)境溫度的不同，設(shè)置37℃操作組和22℃操作組；根據(jù)薄膜上包被的保護(hù)液微滴體積的不同，設(shè)置<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組和>0.5～1.0 μL組；根據(jù)與CPA的接觸時(shí)間的不同，將冷凍卵子分為30～40 s暴露組、>40～90 s暴露組和>90～180 s暴露組。隨后對(duì)各組卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較。結(jié)果22℃操作組小鼠卵子的復(fù)蘇率為81.4%，顯著高于37℃操作組的50.7%，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。選擇22℃的操作環(huán)境，<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組復(fù)蘇率（85.7%、90.5%、83.2%）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。>90～180 s CPA暴露組的卵子復(fù)蘇率為74.7%，低于30～40 s暴露組（83.3%）和>40～90 s暴露組（78.9%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。結(jié)論使用Cryotop法凍融卵母細(xì)胞時(shí)，不必刻意追求<0.1 μL的保護(hù)液加載體積。卵子在高濃度CPA中的暴露時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，且控制在30～90 s內(nèi)對(duì)其存活率無(wú)明顯影響。在常溫（22℃）環(huán)境下進(jìn)行操作可改善復(fù)蘇結(jié)局。

玻璃化冷凍；小鼠；卵母細(xì)胞；溫度；體積；處理時(shí)間；復(fù)蘇率

［Abstract］Objective To evaluate the effects of the temperature，volume and treatment duration of loading CPA solution on the survival rate of oocytes vitrification.Methods Oocytes were obtained from the female KM mice aged six weeks after superovulation.Matured oocytes at MⅡstage were frozen with Cryotop vitrification method at the environmental temperature of 37℃or 22℃，microdrop volume of<0.1，0.1-0.5，>0.5-1.0 μL，and time of oocyte treated in CPA solution of 30-40，>40-90，>90-180 s.The survival rates of warmed oocytes in the different treatments were compared. Results The oocyte survival rate at 22℃of environmental temperature was 81.4%which was significantly higher than that at 37℃（50.7%）（P<0.01）.At the temperature of 22℃，the volume changes of loading microdrops of CPA solution did not influence the survival rate significantly（85.7%，90.5%and 83.2%in<0.1，0.1-0.5 and>0.5-1.0 μL，respectively（P>0.05）.The survival rate seemed to be decreased with the increased treatment duration of oocyte in CPA solution（74.7%in>90-180 s，78.9%in>40-90 s and 83.3%in 30-40 s），but the differences did not reach to statistical significance（P>0.05）.ConclusionItwouldnotbenecessarytominimizetheCPAsolutiondrop'svolumeto lessthan 0.1 μL. Treatment duration of oocyte in CPA should not be too long，and inside 30～90 s has no significant effect on its survival.Controlling environmental temperature under 22℃can improve the survival rate of oocyte vitrification.

［Key words］Vitrification freeze；Mouse；Oocyte；Temperature；Volume；Treatment duration；Survival rate

人類卵子冷凍為需接受放化療的腫瘤患者的生育能力保存，以及卵巢衰竭女性的卵源提供開辟了新的途徑［1］，并可避免胚胎操作凍存引起的倫理和法律糾紛，在人類輔助生殖領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景［2］。但卵母細(xì)胞體積大、細(xì)胞內(nèi)水分含量高、含有紡錘體等特殊結(jié)構(gòu)，故其對(duì)冷凍過(guò)程極為敏感，較胚胎冷凍更困難［3］，凍融復(fù)蘇成功率也曾因此長(zhǎng)期低下。傳統(tǒng)的慢速冷凍可導(dǎo)致維持染色體結(jié)構(gòu)的基因下調(diào)。mRNA保存率低［4-5］，而玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的水分?jǐn)_動(dòng)極?。?］，較之能更好地防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成［7-9］，使卵子凍融復(fù)蘇得以顯著改善，已成為目前卵子凍存最主要的方法。目前常用的卵子玻璃化冷凍技術(shù)有彈射法、開放式拉伸麥管法（OPS）、封閉式拉伸麥管法（CPS）、石英毛細(xì)管法（QMC）、電鏡銅網(wǎng)法和Cryotop法等［10］。其中Cryotop法因熱傳導(dǎo)效果更優(yōu)異，被許多中心所采用。本研究應(yīng)用Cryotop法對(duì)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，通過(guò)比較不同環(huán)境溫度、不同微滴體積和暴露時(shí)間的復(fù)蘇率，分析其對(duì)凍融效果的影響，為Cryotop法冷凍人類卵母細(xì)胞技術(shù)的改善積累經(jīng)驗(yàn)。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡雌性昆明系小白鼠（體重20～25 g），購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2藥物與試劑尿促性腺激素（HMG）與絨毛膜促性腺激素（HCG）均購(gòu)自麗珠制藥廠；透明質(zhì)酸酶（hyaluronidas）及配子處理液G-GAMETE和G-IVF購(gòu)自Vitrolife公司，二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、Dulbecco磷酸鹽緩沖液（DPBS）以及蔗糖均購(gòu)自Sigma公司；人血清白蛋白（HSA）以及石蠟油購(gòu)自Sage公司。

1.1.3耗材與設(shè)備四孔皿購(gòu)自NUNC公司，60 mm培養(yǎng)皿及巴斯德管購(gòu)自Falcon公司，裝載工具Cryotop購(gòu)自KITAZATO公司。超凈工作臺(tái)為丹麥IVFtech，解剖顯微鏡為日本OLYMPUS，培養(yǎng)箱為美國(guó)THEMRO，液氮罐為美國(guó)MVE。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1玻璃化冷凍解凍液的制備冷凍液分為濃度由低到高的4個(gè)梯度：預(yù)平衡液（95%DPBS+5%HSA）；冷凍液Ⅰ（85%DPBS+5%DMSO+5%EG+5%HSA）；冷凍液Ⅱ（75%DPBS+10%DMSO+10%EG+5% HSA）；冷凍液Ⅲ（25%DPBS+20%DMSO+20%EG+30%蔗糖+5%HSA）。解凍液則分為濃度由高到低的4個(gè)梯度：解凍液Ⅰ（65%DPBS+30%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅱ（75%DPBS+20%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅲ（85%DPBS+10%蔗糖+5%HSA）；解凍液Ⅳ（90% DPBS+5%蔗糖+5%HSA）。

1.2.2凍融前小鼠卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備雌鼠腹腔注射10 U的HMG，48 h后再注射10 U的HCG，15 h后將小鼠頸椎脫臼處死，用注射器于覆油的G-GAMETE配子處理液中刺破輸卵管膨大部，擠出成簇卵冠丘復(fù)合物（cumulus-oocyte complexes，COCs）。置于37℃培養(yǎng)箱4 h后，將COCs放入含透明質(zhì)酸酶的四孔皿內(nèi)1 min，再移入剩余3孔的G-GAMETE配子外理液中反復(fù)吹打至顆粒細(xì)胞剝離干凈，選取形態(tài)良好MⅡ期卵母細(xì)胞于G-IVF培養(yǎng)液37℃、6%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h待用。

1.2.3卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇冷凍：根據(jù)冷凍環(huán)境溫度的不同，分別設(shè)置37℃操作組和22℃操作組，即分別在生理溫度（37℃）和室溫（22℃）環(huán)境下，將卵母細(xì)胞依次放入事先熱平衡過(guò)的預(yù)平衡液（2 min），冷凍液Ⅰ（2 min），冷凍液Ⅱ（3 min）以及冷凍液Ⅲ，且根據(jù)卵母細(xì)胞與含高濃度非滲透保護(hù)劑蔗糖的冷凍液（冷凍液Ⅲ）接觸時(shí)間的不同，分別設(shè)置30～40s暴露組、>40～90 s暴露組、>90～180 s暴露組。將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Cryotop聚乙烯薄膜片前端，控制包被卵子的保護(hù)液微滴體積，根據(jù)薄膜上微滴體積的不同，分別設(shè)置<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組。完成以上操作后迅速將載具投入-196℃液氮中，插入管套儲(chǔ)存。解凍：2 d后，將解凍液Ⅰ預(yù)先放到37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱1 h，其余解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均置于室溫下平衡40 min。解凍時(shí)，迅速?gòu)囊旱腥〕鲚d桿，將前端載片浸入解凍液Ⅰ中，輕晃以使得卵子脫落，2 min內(nèi)將卵子轉(zhuǎn)移到解凍液Ⅱ，再分別將卵母細(xì)胞放入解凍液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各3 min，最后轉(zhuǎn)移到G-IVF培養(yǎng)液，放于37℃、6% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱后繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3卵母細(xì)胞存活判斷

經(jīng)解凍的卵母細(xì)胞放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日早間觀察依然可見透明帶與細(xì)胞膜完整，卵周間隙清晰，大小正常，折光度好，且沒(méi)有明顯的胞漿溢出與皺縮，則判定其存活良好。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1室溫（22℃）操作環(huán)境下與37℃環(huán)境下小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

在其他實(shí)驗(yàn)條件相同情況下（加載CPA微滴體積< 0.1 μL，卵母細(xì)胞與高濃度CPA的接觸時(shí)間<90 s），22℃操作組小鼠卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率高于37℃操作組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

表1　不同操作環(huán)境溫度下小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

2.2加載不同體積CPA微滴組間小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

選擇22℃的操作環(huán)境，卵母細(xì)胞與高濃度CPA的接觸時(shí)間<90 s時(shí)，加載不同體積（<0.1 μL組、0.1～0.5 μL組、>0.5～1.0 μL組）的CPA微滴的小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2　加載不同體積CPA微滴組間小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

2.3投入液氮前接觸不同時(shí)間高濃度CPA的小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

在22℃的操作環(huán)境下，控制卵母細(xì)胞與高濃度CPA（冷凍液Ⅲ）的接觸時(shí)間，使其分別為30～40、>40～90、>90～180 s暴露組，凍融后發(fā)現(xiàn)，>90～180 s暴露組復(fù)蘇率低于30～40 s暴露組和>40～90 s暴露組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3　投入液氮前接觸不同時(shí)間高濃度CPA（冷凍液Ⅲ）的小鼠卵母細(xì)胞復(fù)蘇率比較

3討論

玻璃化冷凍操作溫度的選擇尚存在爭(zhēng)論，鞏曉蕓等［11］通過(guò)凍融人卵裂期胚胎發(fā)現(xiàn)24-26℃的冷凍操作環(huán)境溫度得到的復(fù)蘇率為90%，要顯著高于37℃組（55%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。鄒立波等［12］則發(fā)現(xiàn)在25℃操作環(huán)境下凍融小鼠囊胚后獲得的孵化率為50.9%（28/55），顯著高于37℃組的21.3%（13/ 61），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但孫瑩璞等［13］在37℃條件下玻璃化凍融小鼠GⅤ期和MⅡ期卵母細(xì)胞都能得到較高的復(fù)蘇率分別為86.0%（129/150）和81.7%（121/145）。本研究分別在37℃和室溫（22℃）冷凍操作環(huán)境下對(duì)小鼠成熟期卵母細(xì)胞進(jìn)行凍融，發(fā)現(xiàn)室溫（22℃）下操作較之37℃環(huán)境能獲得更高的復(fù)蘇率（P<0.01），與前兩位學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。Rall等［14］認(rèn)為降溫可以減低高濃度CPA對(duì)胚胎造成的化學(xué)毒性，故本實(shí)驗(yàn)中37℃冷凍操作環(huán)境組復(fù)蘇率不高的原因可能是由于更多的高濃度滲透性冷凍保護(hù)劑DMSO和EG進(jìn)入到卵母細(xì)胞內(nèi)，對(duì)其產(chǎn)生化學(xué)毒性作用。而卵母細(xì)胞與分裂期胚胎比較，其表面積與體積比例明顯較小，細(xì)胞內(nèi)含水量大，細(xì)胞膜滲透性低，且具有對(duì)溫度極為敏感的紡錘體等特殊結(jié)構(gòu)，這都使得卵母細(xì)胞顯得更為脆弱，更易形成冰晶，玻璃化凍融難度更高［15］。因此，在冷凍過(guò)程中選擇合適的操作溫度（22℃）至關(guān)重要。

玻璃化是由液相直接轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N玻璃狀的固體狀態(tài)的過(guò)程［15］，避免了晶體態(tài)的出現(xiàn)，從而有效防止了冰晶對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷。實(shí)現(xiàn)玻璃化狀態(tài)的關(guān)鍵是提供足夠快的降溫速度，而降溫速度又與冷凍載體的類型和液體體積有關(guān)。目前常用的卵子玻璃化冷凍載體有拉伸麥管，石英毛細(xì)管，電鏡銅網(wǎng)和Cryotop聚乙烯薄片載桿，其能達(dá)到的降溫速度分別為5521［16］、10 000［17］、3000℃/min［18］和37 500℃/min［16］。本實(shí)驗(yàn)選用以上4類載體中熱傳導(dǎo)降溫效率最高的Cryotop載具對(duì)小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍，并通過(guò)比較加載不同體積的CPA微滴，來(lái)探討液體體積這一因素對(duì)凍融效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同CPA液滴體積加載組間復(fù)蘇率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Kuwaya ma［19］提出Cryotop法時(shí)認(rèn)為加載在塑料薄膜帶（寬0.4 mm，長(zhǎng)20 mm，厚0.1 mm）上的包含有卵母細(xì)胞的保護(hù)液小滴體積應(yīng)<0.1 μL。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，當(dāng)液滴體積<1 μL時(shí)，液滴體積的增大并沒(méi)有降低卵母細(xì)胞的復(fù)蘇率，說(shuō)明1 μL的CPA包被體積未達(dá)到影響胚胎復(fù)蘇能力的閾值。而拉伸麥管法中，所用到的細(xì)麥管裝載的液體體積達(dá)到2 μL，且脈管壁直接隔斷了含配子的保護(hù)液與液氮的接觸，阻止了熱量的直接傳導(dǎo)，但即便如此，其仍能達(dá)到5521℃/min的降溫速率，并獲得較好的冷凍效果。因此，本研究認(rèn)為在使用Cryotop法進(jìn)行玻璃化冷凍時(shí)，液滴體積不必刻意追求<0.1 μL，當(dāng)體積<1 μL時(shí)，其大小改變不對(duì)復(fù)蘇率造成影響。

玻璃化狀態(tài)的實(shí)現(xiàn)，需要比傳統(tǒng)慢速程序化冷凍所用濃度高得多的CPA的參與，但濃度的升高同時(shí)意味著CPA對(duì)卵子或胚胎毒性和滲透性損傷的增加［15］。因此，控制好配子與高濃度CPA的平衡接觸時(shí)間，使其既滿足玻璃化冷凍的需要，又盡可能減少CPA帶來(lái)的毒性作用非常重要。杜娟等［20］收集IVF周期未受精人成熟卵子，將其分組后控制卵子與高濃度CPA的接觸時(shí)間，發(fā)現(xiàn)10～20 s暴露組的復(fù)蘇率要顯著高于40～50 s暴露組（P<0.05）。但鞏曉蕓等［11］分別比較了2、4、8個(gè)細(xì)胞鼠胚以及人卵裂期胚胎和玻璃化液接觸不同時(shí)間下的復(fù)蘇率，發(fā)現(xiàn)各組胚胎復(fù)蘇率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究在22℃的操作環(huán)境下，控制小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞與高濃度CPA的接觸時(shí)間，發(fā)現(xiàn)30～40 s組和>40～90 s組的復(fù)蘇率十分接近，這說(shuō)明90 s的接觸時(shí)間未達(dá)到影響卵子復(fù)蘇能力的閾值。但>90～180s組的復(fù)蘇率要低于>40～90 s組和30～40 s組，且許多卵子出現(xiàn)了過(guò)度脫水，體積皺縮，融解時(shí)細(xì)胞恢復(fù)緩慢甚至無(wú)法擴(kuò)張到冷凍前體積的情況，這又提示過(guò)長(zhǎng)的暴露時(shí)間的確會(huì)增加CPA對(duì)卵子的毒性和滲透性損傷，對(duì)卵子凍融不利。

綜上所述，在采用Cryotop法對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍時(shí)，要多因素綜合考慮，選擇合適的冷凍操作環(huán)境溫度，加載恰當(dāng)?shù)母邼舛菴PA微滴體積以及控制適宜的卵子于CPA的暴露時(shí)間，以期達(dá)到最佳的玻璃化凍融效果。

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Effect of the temperature，volume and treatment duration of CPA microdrop on mouse oocytes vitrification

RAO Jinpeng1QIU Feng1LIU Qing1CAI Yiting1JIN Min1JIN Fan2
1.Reproductive Medicine Center，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Zhejiang Province，Hangzhou310052，China；2.Reproductive Medicine Center，Women's Hospital，School of Medicine，Zhejiang University，Zhejiang Province，Hangzhou310006，China

R321

A

1673-7210（2016）09（c）-0008-04

2016-06-15本文編輯：任念）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81571500）。

饒金鵬（1987-），男，碩士；研究方向：輔助生殖技術(shù)。

金帆（1958-），男，碩士，教授；研究方向：輔助生殖技術(shù)。