何曉琴　徐細(xì)明　余佳駿　甘園園　韓娜娜　張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

lncRNA-AK058003誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

何曉琴徐細(xì)明余佳駿甘園園韓娜娜張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

目的探討lncRNA-AK058003在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法采用lip2000轉(zhuǎn)染法分別將過表達(dá)質(zhì)粒（lncRNA-AK058003組）和空質(zhì)粒（Vector組）轉(zhuǎn)入HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法來檢測凋亡細(xì)胞及凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果構(gòu)建上調(diào)lncRNA-AK058003的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株后，凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡率明顯高于Vector組（P<0.05）；過表達(dá)lncRNA-AK058003能抑制MAPK信號通路關(guān)鍵磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)論lncRNA-AK058003能夠調(diào)控MAPK信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

lncRNA-AK058003；肝癌；MAPK通路；凋亡

［Abstract］Objective To explore the mechanism of lncRNA-AK058003 in liver cancer cells apoptosis.Methods Flow cytometry and protein immunoblot methods were applied to detecting cell apoptosis and related proteins，after transfected lncRNA-AK058003 or vector in HepG2 and SMMC-7721 cells with lip2000.Results Transfected HepG2 and SMMC-7721 with construction of over-expression lncRNA-AK058003 plasmid，the number of apoptotic cells and apoptotic rate are significantly higher than the empty plasmid group（P<0.05）.The key phosphorylated proteins of MAPK signal pathway were suppressed by lncRNA-AK058003.Conclusion LncRNA-AK058003 can promote liver cancer cells apoptosis by adjusting MAPK signaling pathways.

［Key words］lncRNA-AK058003；Liver cancer；MAPK signal pathway；Apoptosis

原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中男性肝癌死亡率在腫瘤相關(guān)性死亡中位居第二［1］，而肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確。前期研究表明肝癌的發(fā)生與細(xì)胞凋亡分子和信號通路異常相關(guān)［2-4］。因此從分子水平研究肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并將特異性分子作為臨床治療新靶點(diǎn)。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是近年來備受矚目的一類長度大于200 nt的非編碼RNA，其位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物［5-7］。由于lncRNA無開放閱讀框，所以沒有或很少具有編碼蛋白質(zhì)的能力，主要是以RNA形式，在表觀遺傳學(xué)（包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控（通過募集或者干擾一些轉(zhuǎn)錄因子在蛋白編碼基因上游啟動子區(qū)定位，而影響下游基因的表達(dá)）及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［8-9］。目前，已有文獻(xiàn)證實(shí)部分lncRNA在腫瘤凋亡中發(fā)揮重要作用［10-11］，而lncRNA與肝癌凋亡相關(guān)的文獻(xiàn)相對較少。因此，深入探討lncRNAs在肝癌凋亡的作用及其分子機(jī)制，將有助于全面地了解肝癌發(fā)生的過程。

1　對象與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721購于中科院上海細(xì)胞庫，按照50%培養(yǎng)基，40%血清和10% DMSO進(jìn)行梯度凍存，保存于液氮中。HepG2采用含有10%Gibico胎牛血清和1%青-鏈霉素的Hyclone DMEM培養(yǎng)基，而SMMC-7721在含10%Gibico胎牛血清和1%青-鏈霉素的Hyclone RPMI培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

將構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol提取總RNA［12］，并用Nano-Drop2000C紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度。然后按TOYOBO試劑盒（QPK-201，日本）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后按照Takara qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)立3個復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參基因，7500 Fast System SDS軟件分析Ct值，采用2－ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列由武漢巴菲爾生物有限公司設(shè)計(jì)合成：GAPDH-F：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3'；GAPDH-R：5'-AGGG GCCATCCACAGTCTTC-3'；AK058003-F：5'-GGGAAC AAAGATGGTTTCTACGT-3'；AK058003-R：5'-ACTGGT TCATAGTTAGGCTGGAT-3'。

1.3過表達(dá)lncRNA-AK05800質(zhì)粒的構(gòu)建

用PCR儀擴(kuò)增并獲取目的基因，瓊脂糖電泳進(jìn)行驗(yàn)證。然后將10 μL的PCR產(chǎn)物與載體GV144（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司）交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 μL感受態(tài)細(xì)胞E.coli中，取適量菌液均勻涂布在含有卡那霉素抗性的瓊脂糖平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。最后對菌液和質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測序。

1.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系

細(xì)胞融合度達(dá)50%～80%時，更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。分別用Optimem稀釋lip2000（Thermo，Invitrogen）和質(zhì)粒，靜置5 min后將兩者輕輕混合，室溫孵育20 min加入培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)［10］。

1.5細(xì)胞凋亡檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h的腫瘤細(xì)胞上清，用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌兩次，用凋亡試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）240 μL 1xBinding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-氨基放線菌素D（7-AAD）輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，再加入260 μL 1×Binding buffer稀釋。用流式細(xì)胞儀分析（Becton-Dickinson，USA），采用FACS express version 3軟件分析結(jié)果。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

提取肝癌細(xì)胞系總蛋白，4℃，12 000 r/min離心5 min，將上清分裝到1.5 mL的離心管中放于-20℃保存。制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算出上樣體積，與上樣緩沖液1∶1混勻，沸水浴30 min，加樣。60 mA恒流電泳約1 h，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過夜孵育（表1），二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶10 000）孵育，漂洗，經(jīng)ECL試劑盒（BestBio，上海）顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。通過Pathway分析預(yù)測lncRNA-AK058003與MAPK信號通路相關(guān)，采用Western blot檢測MAPK信號通路中的3個主要蛋白：ERK、P38、JNK及磷酸化的蛋白。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　抗體詳細(xì)信息

2　結(jié)果

2.1lncRNA-AK058003質(zhì)粒構(gòu)建和克隆篩選

構(gòu)建lncRNA-AK058003過表達(dá)的質(zhì)粒（圖1A），以瓊脂糖凝膠電泳初步表明lncRNA-AK058003目的序列成功與載體結(jié)合（圖1B）。經(jīng)測序分析，進(jìn)一步證明重組體中含過表達(dá)的目的片段，且堿基序列完整（圖1C）。

圖1　LncRNA-AK058003質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

2.2瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系后lncRNA-AK058003表達(dá)

RT-PCR及qRT-PCR結(jié)果顯示：HepG2和SMMC-7721轉(zhuǎn)染lncRNA-AK058003組顯著高于Vector組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染lncRNA-AK058003成功。

2.3lncRNA-AK058003促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示：在HepG2中過表達(dá)lncRNA-AK058003后凋亡細(xì)胞數(shù)增多（圖3A～B），凋亡率明顯高于Vector組（P<0.01）（圖3E）；同時也在SMMC-7721中進(jìn)行檢測，過表達(dá)lncRNA-AK058003后凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡率均顯著高于Vector組（P<0.05）（圖3C～E）。為了證明lncRNA能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，采用Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白變化。如圖3F所示：過表達(dá)lncRNAAK058003后，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)量較空質(zhì)粒組增高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量降低。進(jìn)一步證明lncRNA-AK058003能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

圖2　轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系A(chǔ)K058003的相對表達(dá)量

***

**

圖3　LncRNA-AK058003誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

2.4lncRNA-AK058003與MAPK信號通路的關(guān)系

過表達(dá)lncRNA-AK058003的HepG2中P-ERK，P-P38及P-JNK蛋白變化較Vector組顯著降低，然而ERK和P38蛋白的變化不顯著，說明lncRNAAK058003可能參與抑制MAPK信號通路的激活。見圖4。

圖4　lncRNA-AK058003與MAPK信號通路的關(guān)系

3　討論

細(xì)胞凋亡是為調(diào)控機(jī)體的發(fā)育和維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的主動程序性死亡的過程［13］。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤的無限制增長是腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制失控所致［14］。最近的研究表明，凋亡誘導(dǎo)療法是一種安全有效的抗癌方法，從而可能成為癌癥治療方式之一［15］。因此，尋找誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因有助于開辟腫瘤治療的新天地。本研究首次探討了lncRNA-AK058003與肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，通過上調(diào)lncRNA-AK058003的表達(dá)，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK058003能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，增加促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并且可以抑制MAPK信號通路的激活。

前期的研究中，Wang等［16］在胃癌中新發(fā)現(xiàn)缺氧lncRNA-AK058003通過正向調(diào)控SNCG的CpG島甲基化來促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。同時He等［17］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)LncRNA-AK058003通過調(diào)控γ-synuclein的表達(dá)水平促進(jìn)乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。這兩項(xiàng)研究均表明lncRNA-AK058003在腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，卻沒有討論該基因與腫瘤凋亡的關(guān)系。另外，Ma等［10］發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子能夠誘導(dǎo)lncRNA-HULC調(diào)節(jié)miR-9的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；Huang等［11］研究表明，lncRNA-TUG1在核轉(zhuǎn)錄因子（SP1）誘導(dǎo)下抑制KLF2蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。前兩項(xiàng)研究均探討了lncRNA參與肝癌細(xì)胞的凋亡的分子機(jī)制，未對具體信號通路進(jìn)行研究。近期的研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路的異常與肝癌的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)［18-20］。這些研究均表明，lncRNA和MAPK信號通路在肝癌的發(fā)生機(jī)制中扮演著重要的角色。

當(dāng)然，本研究仍然存在不足：①沒有檢測臨床標(biāo)本lncRNA的表達(dá)量；②檢測方式單一；③lncRNAAK058003調(diào)控MAPK信號通路的機(jī)制不明確。本研究組后期的研究將對lncRNA-AK058003在肝癌組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測，并探討該基因在肝癌發(fā)生中的分子機(jī)制。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK058003能夠調(diào)控MAPK信號通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這將為肝癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷和預(yù)后判斷、新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，有著重要的臨床意義。

［1］Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA：A Cancer Journal for Clinicians，2015，65（2）：87-108.

［2］Liu X，Li L，Li J，et al.Insulin resistance contributes to multidrug resistance in HepG2 cells via activation of the PERK signaling pathway and upregulation of Bcl-2 and P-gp［J］.Oncology Reports，2016，35（5）：3018-3124.

［3］Hung MH，Tai WT，Shiau CW，et al.Downregulation of signal transducer and activator of transcription 3 by sorafenib：a novel mechanism for hepatocellular carcinoma therapy［J］. World J Gastroenterology，2014，20（41）：15269-15274.

［4］Luedde T，Kaplowitz N，Schwabe RF.Cell death and cell death responses in liver disease：mechanisms and clinical relevance［J］.Gastroenterology，2014，147（4）：765-783.

［5］Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136（4）：629-641.

［6］Derrien T，Johnson R，Bussotti G，et al.The GENCODE v7 catalog of human long non-coding RNAs：analysis of their gene structure，evolution，and expression［J］.Genome Research，2012，22（9）：1775-1789.

［7］ENCODE Project Consortium.An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome［J］.Nature，2012，489（7414）：57-74.

［8］Mercer TR，Dinger ME，Mattick JS.Long non-coding RNAs：insights into functions［J］.Nature Reviews Genetics，2009，10（3）：155-159.

［9］George J，Patel T.Noncoding RNA as therapeutic targets for hepatocellular carcinoma［J］.Seminars in Liver Disease，2015，35（1）：63-74.

［10］Ma Y，Huang D，Yang F，et al.Long Noncoding RNA Highly Upregulated in Liver Cancer Regulates the Tumor Necrosis Factor-α-Induced Apoptosis in Human Vascular Endothelial Cells［J］.DNA Cell Bio，2016.PMID：26981838.

［11］Huang MD，Chen WM，Qi FZ，et al.Long non-coding RNA TUG1 is up-regulated in hepatocellular carcinoma and promotes cell growth and apoptosis by epigenetically silencing of KLF2［J］.Molecular Cancer，2015，14（9）：165.

［12］Zhang MX，Xu XM，Zhang P，et al.Effect of silencing NEK2 on biological behaviors of HepG2 in human hepatoma cells and MAPK signal pathway［J］.Tumor Biology，2016，37（2）：2023-2035.

［13］Horvitz HR.Genetic control of programmed cell death in the nematode Caenorhabditis elegans［J］.Cancer Research，1999，59（7）1701s-1706s.

［14］White E.Mechanisms of apoptosis regulation by viral oncogenes in infection and tumorigenesis［J］.Cell Death And Differentiation，2006，13（8）：1371-1377.

［15］Wang F，Wang H，Sun X，et al.Apoptosis-induction is a novel therapeutic strategy for gastrointestinal and liver cancers［J］.Current Gene Therapy，2015，15（2）：193-200.

［16］Wang Y，Liu X，Zhang H，et al.Hypoxia-inducible lncRNA-AK058003 promotes gastric cancer metastasis by targeting gamma-synuclein［J］.Neoplasia，2014，16（12）：1094-1106.

［17］He K，Wang P.Unregulated long non-coding RNA-AK 058003 promotes the proliferation，invasion and metastasis of breast cancer by regulating the expression levels of the γ-synuclein gene［J］.Experimental and Therapeutic Medicine，2015，9（5）：1727-1732.

［18］Zhong W，Shen WF，Ning BF，et al.Inhibition of extracellular signal-regulated kinase1 by adenovirus mediated small interfering RNA attenuates hepatic fibrosis in rats［J］. Hepatology，2009，50（5）：1524-1536.

［19］Tsuboi Y，Ichida T，Sugitani S，et al.Overexpression of extracellular signal-regulated protein kinase and its correlation with proliferation in human hepatocellular carcinoma［J］.Liver International，2004，24（5）：432-436.

［20］Jia YL，Shi L，Zhou JN，et al.Epimorphin promotes human hepatocellular carcinoma invasion and metastasis through activation of focal adhesion kinase/extracellular signal regulated kinase/matrix metalloproteinase-9 axis［J］.Hepatology，2011，54（5）：1808-1818.

Mechanism of lncRNA-AK058003 in liver cancer cells apoptosis

HE Xiaoqin XU Ximing YU Jiajun GAN Yuanyuan HAN Nana ZHANG Meixia
Cancer Center，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R735.7

A

1673-7210（2016）09（c）-0023-04

2016-04-14本文編輯：任念）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012FKC14301）。

徐細(xì)明（1976-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師；研究方向：lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究。