盧妙蓮，李云，曾瑞麗，林海標(biāo)，余冬青，張秀娟，曹楠楠，王建兵.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 500 .廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，廣東 廣州 500 .廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科，廣東 廣州 500

丹參對子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞MMP-9 mRNA及蛋白表達的影響

盧妙蓮1，李云1，曾瑞麗1，林海標(biāo)1，余冬青2，張秀娟3，曹楠楠1，王建兵1
1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510120 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510120 3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝病科，廣東 廣州 510120

目的：觀察丹參對子宮內(nèi)膜異位癥間質(zhì)細胞基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）mRNA和蛋白表達的影響，探討其可能的機制。方法：用混合酶消化法進行間質(zhì)細胞培養(yǎng)，分別加入空白對照（空白組），不同濃度丹參（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L）（丹參1組、丹參2組、丹參3組、丹參4組）。細胞常規(guī)培養(yǎng)48 h后，用CCK-8法觀察不同濃度的丹參對間質(zhì)細胞增殖的影響，RT-PCR法檢測其對MMP-9 mRNA表達的影響，Western blotting檢測其對MMP-9蛋白含量的影響。結(jié)果：CCK-8法結(jié)果顯示，除丹參1組外，其余丹參組間質(zhì)細胞增殖與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，除丹參1組外，各丹參組MMP-9mRNA表達降低、MMP-9蛋白表達量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：丹參可以抑制異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖，同時可以抑制MMP-9mRNA和蛋白的表達，從而降低對細胞外基質(zhì)的降解，最終抑制子宮異位內(nèi)膜的種植、侵襲和轉(zhuǎn)移。

子宮內(nèi)膜異位癥；丹參凍干粉；異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞；基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EM）是婦科疑難病、多發(fā)病。子宮內(nèi)膜細胞進行異位侵襲和種植過程中，必須降解該組織細胞外基質(zhì)和基底膜，基質(zhì)金屬酶（matrix metalloproteinase，MMPs）家族中的MMP-9可能發(fā)揮重要作用［1］。現(xiàn)應(yīng)用不同濃度丹參對EM在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的MMP-9 mRNA及蛋白進行干預(yù)，探討其可能的機制。

1　材料及方法

1.1試劑與藥物高糖DMEM（Thermo公司）、胎牛血清（Hyclone公司）、Trizol（Invitrogen公司）、胰蛋白酶（Science公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司）、PCR試劑盒（Tiangen公司）、二甲基亞砜（DMSO）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨（APS）、甘氨酸（GLY）、MMP-9兔抗人多克隆抗體、β-actin兔多克隆抗體，以上試劑購自廣州碧云天生物公司。丹參的凍干粉由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中心實驗室制備加工后-20℃保存。

1.2儀器與設(shè)備CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）、Thermo MultiskanAscent酶標(biāo)儀、96孔熱循環(huán)儀（AB公司）、倒置相差顯微鏡（Nikon公司）、CP225D十萬分之一分析天平（Sartorius公司）、紫外凝膠成像儀（Bio-Rad公司）、穩(wěn)定電流電泳儀（北京六一儀器）。

1.3細胞培養(yǎng)與傳代實驗獲得了廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。15例異位內(nèi)膜組織均來自2014年5月－2014年10月本院婦科行卵巢巧克力囊腫（增殖期）住院手術(shù)的患者。培養(yǎng)方法參照文獻［2］。將子宮內(nèi)膜組織剪成肉眼模糊狀，加入膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶的混合酶，消化后的細胞經(jīng)38 μm（400目）篩網(wǎng)過濾后得到含間質(zhì)細胞的濾液。將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后將未貼壁細胞吸出，加入新的培養(yǎng)液，放入37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)。待細胞極盡鋪滿培養(yǎng)瓶后進行傳代培養(yǎng)。傳代次數(shù)越多，間質(zhì)細胞純度越高［3］。

1.4CCK-8實驗取對數(shù)生長期間質(zhì)細胞，制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育，使細胞處于G0期。每孔分別加入不同濃度的培養(yǎng)基100μL（空白組加入不含胎牛血清DMEM，丹參條件組加入終濃度為1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L4個組即丹參1組，丹參2組，丹參3組，丹參4組），每組各設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，每孔分別加入10 μL CCK-8液孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度值（OD值）。

1.5RT-PCR檢測PCR擴增MMP-9基因，采用GAPDH作為內(nèi)參照，引物序列如下：MMP-9上游引物5′-TCCCTG GAGACCTGAGAACC-3′，下游引物5′-GGCAAGTCTTCCG AGTAGTTT-3′，擴增產(chǎn)物 312bp；GAPDH上游引物 5′-GGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，下游引物5′-CACCATC TTCCAGGAGCGAG-3′，擴增產(chǎn)物352bp；反應(yīng)條件為：94℃3 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，72℃延伸5 min，30個循環(huán)。用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析灰度值，以各條帶與GAPDH內(nèi)參條帶的比值，作為MMP-9 mRNA相對表達水平。

1.7Western blotting檢測按試劑盒說明書提取總蛋白，按BCA法測量蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品，用SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳后進行轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），300 mA恒流轉(zhuǎn)2 h，隨后將PVDF膜置于含50g/L脫脂牛奶溶液中進行封閉，MMP-9和β-actin一抗分別用抗體稀釋液稀釋，膜置于一抗稀釋液中，于4℃下平緩搖動過夜，二抗辣根過氧化物標(biāo)記的IgG多克隆抗體按1∶5000稀釋，膜在二抗稀釋液中室溫慢搖1 h，暗室內(nèi)曝光檢測。用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)將每個條帶灰度值數(shù)字化，目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表目的蛋白的相對含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用（±s）表示。多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），將所有的條件組分別與指定的對照組進行比較。

2　結(jié)果

2.1間質(zhì)細胞形態(tài)4 h后細胞基本全部貼壁，聚集成團并呈多角形；72 h后呈長梭形或紡錘形，交織成網(wǎng)；傳代后的細胞生長較快，而且性狀穩(wěn)定，隨著傳代次數(shù)的增加，間質(zhì)細胞的純度也越高。

2.2各組間質(zhì)細胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達比較見表1、圖1、圖2。CCK-8法結(jié)果顯示，除丹參1組外，其余丹參組間質(zhì)細胞增殖與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，除丹參1組外，各丹參組MMP-9 mRNA表達降低、MMP-9蛋白表達量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1　各組間質(zhì)細胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達比較（±s）

表1　各組間質(zhì)細胞增殖、MMP-9mRNA及蛋白表達比較（±s）

與空白組比較，①P＜0.05

組別空白組丹參1組丹參2組丹參3組丹參4組O D值0.754±0.029 0.738±0.021 0.669±0.036①0.456±0.034①0.358±0.028①M M P-9 mRN A 0.699±0.089 0.685±0.009 0.602±0.013①0.549±0.017①0.411±0.007①M M P-9蛋白0.819±0.010 0.798±0.039 0.705±0.119①0.646±0.388①0.549±0.214①

3　討論

目前由于西藥和手術(shù)給EM患者身心帶來損傷，而采用中醫(yī)治療不僅能緩解這種狀況，還能提高受孕率，具有復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點。中醫(yī)學(xué)認為，瘀血內(nèi)停是導(dǎo)致EM臨床癥狀和體征的主要因素，故活血化瘀，行氣止痛為其治療大法［4］，并根據(jù)辨證輔以補腎健脾，疏肝行氣，清熱解毒化痰制品。丹參又名赤參，具有活血調(diào)經(jīng)，祛瘀止痛，涼血消癰，清心除煩，養(yǎng)血安神等功效。

圖1　不同條件組MMP-9 mRNA相對表達量

圖2　不同條件組MMP-9蛋白相對表達量

EM在早期主要通過黏附性糖蛋白分子黏附于腹膜間皮表面，繼而破壞細胞外基質(zhì)，所以細胞外基質(zhì)的降解是新生血管形成以及組織結(jié)構(gòu)重建的基本條件［5］。有許多因子在細胞外基質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用，其中對MMPs家族研究較為廣泛，MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶。研究表明，異位內(nèi)膜組織中MMP-9表達明顯增強，提示其在EM的發(fā)生、發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［6］。它幾乎能降解細胞外基質(zhì)中的所有成分，但主要降解細胞外基質(zhì)中Ⅲ型/Ⅳ型膠原和明膠3種主要成分，并能促進心血管的生成，在子宮內(nèi)膜細胞的黏附、侵襲和生長過程中發(fā)揮重要作用［7］。

本研究通過建立體外子宮異位癥間質(zhì)細胞培養(yǎng)體系，消除體內(nèi)外各種影響因素，發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞在給予1 mg/L藥物后，作用不明顯。給予5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L不同濃度藥物刺激后，間質(zhì)細胞的增殖受到影響（P＜0.05），丹參對異位間質(zhì)細胞生長的抑制作用呈劑量依賴性，隨著濃度增高而作用增強，表明丹參對異位內(nèi)膜細胞增殖具有抑制作用；同時觀察到，除1 mg/L組外，其它組MMP-9 mRNA和MMP-9蛋白表達水平與空白組具有顯著差異（P＜ 0.05），子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞經(jīng)丹參作用24 h后MMP-9 mRNA和蛋白表達量明顯下調(diào)。所以丹參可以通過降低MMP-9的產(chǎn)生，從而降低對細胞外基質(zhì)的破壞達到減輕臨床癥狀的目的。但是中藥是通過多種途徑發(fā)揮作用，僅靠本實驗還不能確定丹參具體能夠影響到的細胞因子和酶，對此還有待深入系統(tǒng)的探討和研究。

［1］王紅靜，黃倩，安寒，等.中草藥治療子宮內(nèi)膜異位癥的系統(tǒng)評價［J］.Chinese J Evidence-Based Medicine，2004，4（9）：602-608.

［2］ Brueggmann D，Templeman C，Starzinski-Powitz A，etal.Novel three-dimensional invitromodelsof ovarian endometriosis［J］.J Ovarian Res，2014，7：17.

［3］唐雪蓮，謝梅青，張鳳麗.高純度分離子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細胞和體外培養(yǎng)技術(shù)［J］.中山大學(xué)學(xué)報，2003，24（6）：589-592.

［4］陳曜.扶正祛瘀法治療子宮內(nèi)膜異位癥臨床研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，12（10）：134-135.

［5］崔俊玉，楊堯華，張晟寧.Survivin和MMP-9在子宮內(nèi)膜異位癥中表達及相關(guān)性分析［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2011，33（8）：746-748.

［6］ Sharpe-Timms KL，Zimmer RL，Jolliliff WJ，et al. Gonadotropin-releasinghormoneagonist（GnRH-a）therapy alters activity of plasminogen activators，matrix metalloproteinases and their inhibitors in rat models for adhesionformationandendometriosis：potential GnRH-a-regulatedmechanismsreducingadhesion formation［J］.Fertility and Sterility，1998，69（5）：916-923.

［7］Giudice LC，Tazuke SI，Swiersz L.Status of current research on endometriosis［J］.J Reprod Med，1998，43：252-262.

（責(zé)任編輯：駱歡歡）

Effect of Salviae Miltiorrhizae on Stromal Cells MMP-9 mRNA and Protein Expression of Endometriosis

LU Miaolian，LI Yun，ZENG Ruili，LIN Haibiao，YU Dongqing，ZHANG Xiujuan，CAO Nannan，WANG Jianbing

Objective：To observe the effect of salviae miltiorrhizae on matrix metalloproteinase 9（MMP-9）mRNA and protein expression of endometriosis and discuss their feasible mechanism.Methods：Cultured stromal cells by the method of mixed enzymatic digestion，added respectively nothing（blank group）or different concentration of salviae miltiorrhizae（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L）（salviae miltiorrhizae 1 group，salviae miltiorrhizae 2 group，salviae miltiorrhizae 3 group，salviae miltiorrhizae 4 group）.After cells were routine cultured for 48 h，observed the effect of different concentration of salviae miltiorrhizae on stromal cell proliferation by the method of CCK-8，and detected the effect on MMP-9 mRNA expression by the method of RT-PCR，then detected the effect on MMP-9 protein level by the method of Western blotting.Results：The result of CCK-8 showed that，differences of stromal cell proliferation between blank group and salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group were statistical significant（P＜0.05）.Comparing with blank group，MMP-9mRNA expression was decreased and MMP-9 protein expression also was reduced in salviae miltiorrhizae groups other than salviae miltiorrhizae 1 group，differences being statistical significant（P＜0.05）.Conclusion：Salviae miltiorrhizae can inhibit ectopic stromal cell proliferation，meanwhile inhibit MMP-9mRNA and protein expression，consequently reduce degradation of extra cellular matrix，and ultimately inhibit cultivation，invasion and metastasis of uterus ectopic endometrium.

Endometriosis；Salviae miltiorrhizae freeze-dried powder；Ectopic stromal cell；Matrix metalloproteinase 9（MMP-9）

R711.71

A

0256-7415（2016）04-0278-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.105

2015-04-23

廣東省中醫(yī)藥局課題（20132154）

盧妙蓮（1979-），女，副主任技師，研究方向：臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化。