王建權(quán)，李奎永.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 慈溪 35300；.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 0037

大血藤總黃酮分離純化工藝研究

王建權(quán)1，李奎永2
1.慈溪市中醫(yī)醫(yī)院，浙江 慈溪 315300；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237

目的：研究大孔吸附樹脂分離純化大血藤總黃酮的工藝條件。方法：以蘆丁為對照品，考察大孔吸附樹脂對大血藤總黃酮的富集純化工藝。結(jié)果：采用DA201型大孔吸附樹脂，上樣吸附后，用純化水和30%乙醇除雜，再用5BV、50%乙醇洗脫，可得到總黃酮含量為69.78%的大血藤提取物。結(jié)論：DA201型大孔吸附樹脂在確定的工藝條件下，具有工藝簡單、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，能得到總黃酮純度較高的大血藤提取物。

大血藤；總黃酮；大孔吸附樹脂；分離純化

大血藤亦被稱為大活血、血藤等，為木通科植物大血藤的干燥根莖，多以莖入藥，在我國南方地區(qū)分布廣泛，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)除濕、清熱解毒等功效，臨床上主要用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、痛經(jīng)、腹痛等。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大血藤含有蒽醌類、黃酮類、皂苷類等成分［1］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明［2～3］，其含有的活性成分具有保護(hù)心肌、增加缺氧耐受力、抗菌消炎等作用，在臨床應(yīng)用較為廣泛。大血藤總黃酮為其主要活性成分，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道其分離純化工藝研究，筆者采用大孔吸附樹脂分離純化得到了總黃酮含量較高的大血藤提取物，可為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供參考。

1　材料與儀器

1.1材料蘆丁對照品（中國食品藥品檢定所研究院，120716-201409）；HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201型大孔吸附樹脂（均為滄州寶恩化工有限公司提供）；大血藤購自河北安國藥材市場，經(jīng)鑒定為木通科大血藤屬植物藤莖；甲醇（色譜純）（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，20130320）；其余試劑均為分析純。

1.2儀器Agilent 1200系列高效液相色譜儀（Agilent 1200色譜泵，ELSD-2000蒸發(fā)光散射檢測器，Agilent 1200色譜工作站）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DFT-50手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1方法

2.1.1大血藤總黃酮的提取取大血藤藥材飲片，干燥、粉碎、過篩，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞的錐形瓶中，加40 mL甲醇，超聲提取60 min，放冷、靜置、過濾。濾渣用少量甲醇洗入錐形瓶中，加適量甲醇（總體積約40 mL），超聲提取60 min，放冷、靜置、過濾。合并兩次所得濾液，置于100 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，即得。

2.1.2大血藤總黃酮含量測定采用紫外-可見分光光度法，以蘆丁為對照品，在360 nm處測定其吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=0.2078X-0.2011，R2=0.9991，大血藤提取物照該方法稀釋并測定，計(jì)算其總黃酮含量。

2.1.3上柱液的預(yù)處理稱取大血藤藥材飲片，加10倍量50%乙醇，于80℃加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，濾過、減壓濃縮，配制成適用于樹脂吸附的大血藤浸出液。

2.2工藝參數(shù)的考察與優(yōu)化

2.2.1大孔吸附樹脂的預(yù)處理分別稱取HP20、HPD100、HPD600、HPD700、D101、DA201大孔吸附樹脂適量，乙醇溶脹24 h后回流提取12 h，除去樹脂中殘留的致孔劑等雜質(zhì)。濕法裝柱，用95%乙醇洗滌樹脂至流出液加等量水不呈現(xiàn)白色混濁為止。再用水洗至無醇味。改用5%鹽酸溶液沖洗樹脂，水洗至中性后換用2%氫氧化鈉溶液洗滌，最后水洗至中性即可。

2.2.2大孔吸附樹脂類型的選擇取已處理好的樹脂，置100 mL三角瓶中，加入30 mL固含量為12.14 mg·mL-1的預(yù)處理液。密塞，室溫下以振蕩頻率200次/h振蕩24 h。待充分吸附后，靜置，傾出上清液，并加入適量蒸餾水洗滌樹脂。洗滌液與上清液合并，另器儲存。再加入100 mL95%乙醇在室溫下洗脫。測定殘留液和95%乙醇洗脫液中總黃酮含量，各種類型樹脂對大血藤總黃酮的吸附量及解吸率結(jié)果見表1、表2。

按以下公式計(jì)算吸附率（%）、吸附量（mg/mL）以及解吸率（%）。吸附率（%）=（M0-C1V1）/M0×100%；吸附量（mg/mL）=（M0-C1V1）/V0；解吸率（%）=C2V2/（M0-C1V1）×100%。其中M0為初始加入的大血藤提取物的質(zhì)量；V0為樹脂的體積；C1為殘留液中大血藤總黃酮的濃度；V1為殘留液體積（100 mL）；C2為醇洗液中大血藤總黃酮的濃度；V2為醇洗液體積（100 mL）。

表1　不同類型樹脂對大血藤總黃酮的吸附量　mg·mL-1

表2　不同類型樹脂對大血藤總黃酮的解吸率　%

由表1、表2可知：DA201樹脂對大血藤總黃酮的吸附量為最大，且解吸效果最好。故選用DA201樹脂用于大血藤總黃酮的分離純化。

2.2.3動態(tài)吸附條件的考察選取DA201樹脂為模型，考察不同影響因素對大血藤總黃酮吸附效果的影響。經(jīng)預(yù)處理過的樹脂裝入內(nèi)徑為1 cm的玻璃柱，上樣，飽和吸附6 h后，開始洗脫。

2.2.3.1上樣流速對吸附率的影響上樣流速太快，大血藤總黃酮得不到充分吸附就隨上樣液流出；流速過慢雖可提高大血藤總黃酮的吸附率，但耗時(shí)較多。筆者考察了樹脂柱床體積為5 mL，流速分別為0.5、1.0、1.5 mL·min-1時(shí)對吸附率的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)流速為0.5 mL·min-1，上樣體積為濕樹脂柱床體積20倍時(shí)，大血藤總黃酮基本不泄漏，而流速為1.0 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較晚，可以通過反復(fù)上樣的方法彌補(bǔ)。上樣流速為1.5 mL·min-1時(shí)泄露點(diǎn)出現(xiàn)較早。為節(jié)約上樣時(shí)間，選擇流速1.0 mL·min-1為佳。

2.2.3.2吸附量與樹脂量的關(guān)系見表3。本試驗(yàn)考察了吸附液濃度為245 mg·mL-1，大血藤提取物與大孔樹脂用量的比值（m1∶m2）分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25時(shí)大血藤總黃酮的吸附率。

表3　不同的m1：m2的吸附率

由表3可知，當(dāng)大血藤提取物與大孔樹脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)較合適。雖然大血藤提取物與樹脂之間質(zhì)量比為1∶25時(shí)吸附效果更好，但這與大血藤提取物與樹脂質(zhì)量比為1∶20時(shí)相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故選取大血藤提取物與樹脂之間質(zhì)量比1∶20為最佳條件。

2.3洗脫劑濃度及用量的確定

2.3.1洗脫劑濃度的確定DA201樹脂為非極性樹脂，大血藤總黃酮為中等極性的物質(zhì)，可先用純化水除去水溶性雜質(zhì)，再用不同濃度的乙醇為洗脫劑依次洗脫。乙醇的洗脫濃度梯度為：0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%。結(jié)果顯示，大血藤總黃酮主要富集于70%濃度的乙醇中。故應(yīng)收集50%濃度的乙醇洗脫液。

2.3.2洗脫劑用量的考察經(jīng)飽和吸附的樹脂，先分別用純化水和30%乙醇洗去部分雜質(zhì)，均以洗脫液無色或接近無色為終點(diǎn)，然后更換下一個濃度梯度。收集50%乙醇洗脫液，每2.5 BV（柱床體積）收集一次，并進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)洗脫劑用量為5 BV時(shí)，大血藤總黃酮可基本洗脫完全。故選定洗脫劑用量為5 BV。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室小試所得到的工藝參數(shù)的穩(wěn)定性，保證工業(yè)化生產(chǎn)的順利進(jìn)行，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室研究成果的產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了3批中試分離純化。對50%濃度乙醇洗脫液進(jìn)行了含量測定，可得到總黃酮含量為69.78%（批次1、2、3純度均數(shù)）的大血藤提取物。結(jié)果見表4。三批中試結(jié)果表明，所建立的DA201大孔吸附樹脂法分離純化大血藤總黃酮的方法穩(wěn)定、可靠，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

表4　DA201大孔吸附樹脂純化大血藤總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　討論

大血藤總黃酮為大血藤中較重要的活性成分，近年來有關(guān)大血藤總黃酮報(bào)道的文獻(xiàn)較多，如倪士峰等［4］研究表明，大血藤總黃酮具有清除氧自由基的作用，還可抑制細(xì)胞凋亡、抗腫瘤、防治心血管疾?。桓鹈骶盏龋?］采用聚酰胺薄層層析的方法對大血藤提取物進(jìn)行分離，獲得了10余種黃酮類成分，并采用高效液相色譜法對大血藤葉片、嫩莖、葉柄等藥用部位中黃酮類成分進(jìn)行分析，初步可知大血藤葉片及嫩莖中黃酮類化合物較多。盡管大血藤總黃酮的藥理活性、化學(xué)成分分析較多，但大血藤總黃酮的分離純化研究報(bào)道極少，因而研究大血藤總黃酮分離純化工藝具有較大的應(yīng)用價(jià)值，有可能為臨床提供治療疾病的有效部位［6］。

大孔吸附樹脂的類型、用量等對活性成分的分離純化有較大的影響，本研究前期通過靜態(tài)吸附及動態(tài)解吸附實(shí)驗(yàn)，篩選得到了適合用于大血藤提取物中總黃酮富集的樹脂類型，即中等極性的DA201樹脂，同時(shí)對樹脂的用量與分離純化效果的相關(guān)性進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示，樹脂的用量越大，越有利于其吸附總黃酮，即吸附率越高，但實(shí)際應(yīng)用過程中需充分考慮分離純化工藝的經(jīng)濟(jì)性、可行性、高效性等，因樹脂用量過大會消耗過多的洗脫溶劑，部分雜質(zhì)亦會進(jìn)入洗脫液，導(dǎo)致大血藤總黃酮含量降低，間接降低了樹脂的分離純化效果［7］，故本研究綜合各方面影響大血藤總黃酮純度的因素及工業(yè)化生產(chǎn)的效率，篩選最適宜的樹脂和大血藤提取物的比例，以便提高工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮的效率。

本研究最終確定了大血藤總黃酮的分離純化條件為：大血藤提取物經(jīng)初步后，用已處理好的DA201型大孔吸附樹脂將大血藤提取物進(jìn)行吸附，待吸附完成后，先用純化水及30%乙醇除雜，再用5BV、50%乙醇洗脫，收集洗脫液，過濾并濃縮干燥即得大血藤總黃酮。為保證工藝的可行性，在實(shí)驗(yàn)室研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行了三批中試試驗(yàn)，結(jié)果顯示該分離純化工藝具有工藝穩(wěn)定、可靠，適宜于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的特點(diǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)大血藤總黃酮提供了參考。

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（責(zé)任編輯：劉淑婷）

R284.2

A

0256-7415（2016）04-0275-02

10.13457/j.cnki.jncm.2016.04.104

2015-12-19

王建權(quán)（1979-），男，主管中藥師，主要從事中藥研究工作。