景春娥，李萍，杜欣軍，王碩

（天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457）

鹽酸小檗堿對體外阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用

景春娥，李萍，杜欣軍，王碩*

（天津科技大學食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457）

阪崎克羅諾桿菌是食源性條件致病菌，它能夠在食品生產(chǎn)環(huán)境以及設(shè)備表面形成生物膜，從而成為食品的潛在污染源。本研究探討了鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用，旨在從中藥來源中尋找可以控制阪崎克羅諾桿菌生物膜的抗菌物質(zhì)。采用XTT法評價了鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌粘附能力及其生物膜形成的影響。鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌的抑制效果表現(xiàn)出了劑量依賴性，MIC90值為512μg/mL。濃度為1024μg/mL的鹽酸小檗堿能夠通過降低阪崎克羅諾桿菌的粘附能力從而顯著抑制生物膜的形成，并且可以部分清除阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜。因此，鹽酸小檗堿對于預防控制阪崎克羅諾桿菌生物膜的形成以及由生物膜導致的臨床感染具有潛在的應(yīng)用價值。

阪崎克羅諾桿菌；生物膜；鹽酸小檗堿

阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）屬于腸桿菌科克羅諾桿菌屬，革蘭氏陰性桿菌［1］，是食源性條件致病菌，它能夠感染不同年齡段的人群，主要導致早產(chǎn)兒或嬰幼兒以及免疫功能低下的成年人患?。?-3］。研究表明，這一致病菌廣泛存在于土壤、水和植物原料（如小麥、大米、藥草和香料等等）［4-5］，具有生存溫度范圍廣［6］和生物膜形成能力強的特點［7］。由于阪崎克羅諾桿菌在惰性表面容易形成生物膜，因此使用熱水或消毒殺菌劑無法將其徹底清除［8］，導致這一致病菌成為食品加工過程中重要的污染源。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，從食品中分離的阪崎克羅諾桿菌菌株已經(jīng)對一些抗生素或殺菌劑表現(xiàn)出了不同程度的抗性［9］?？股啬退幮?，是一個公共健康問題，因為它可能導致常規(guī)治療的失敗，從而引起長期的慢性疾病。

小檗堿是一種異喹啉類生物堿，來自于黃連等植物的根和皮［10-11］。由于小檗堿是帶正電的藥物，易和帶負電荷的離子或分子結(jié)合，常以氯酸鹽或硫酸鹽的形式存在［12］。臨床中將鹽酸小檗堿（berberine hydrochloride）作為常規(guī)治療藥物的主要成分，具有抗腫瘤［13］抗病毒［14］、抗菌［15-16］等多種藥理活性。此外，有研究報道，鹽酸小檗堿在抑制表皮葡萄球菌生物膜中發(fā)揮著重要的作用［17-18］。但是，目前對于使用鹽酸小檗堿抑制阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的報道很少，因此，本研究采用了微孔板法體外建立阪崎克羅諾桿菌生物膜模型，初步探究了鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制作用，為中藥預防和控制阪崎克羅諾桿菌生物膜相關(guān)感染提供科學指導。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

C.sakazakii ATCC BAA-894購自美國菌種保藏中心，為已經(jīng)測序菌株；C.sakazakii IQCC10423購自工業(yè)微生物菌種保藏中心，是從不同阪崎克羅諾桿菌中篩選到的生物膜形成能力較強的菌株。

1.1.2藥品與試劑

LB培養(yǎng)基：Luria-Bertani；PBS（pH7.4）（NaCl8g/L，KCl 0.2 g/L，Na2HPO41.44 g/L，KH2PO40.24 g/L）；鹽酸小檗堿：中國食品藥品檢定研究院，110713-201212；二甲基亞砜（DMSO）：Sigma公司；XTT（2，3-Bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide inner salt）、乳酸鈉（L-Lactic acidsodium salt）、甲萘醌（Menadione）、多利培南（Doripenem）：購自Sigma公司。藥物母液配制：鹽酸小檗堿用二甲基亞砜溶解為6.4 mg/mL的藥物母液，多利培南用0.85%生理鹽水溶解為6.4 mg/mL的藥物母液置-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3儀器與設(shè)備

酶標儀（Multiskan spectrum）購自Thermo公司；96孔微量培養(yǎng)板購自Corning公司。

1.2方法

1.2.1細菌懸液的制備

按照1%的接種量將休止細菌懸液于液體LB培養(yǎng)基中，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)（150 r/min）過夜；再次按1%的接種量轉(zhuǎn)接后同樣條件培養(yǎng)2 h，菌液在600 nm處測OD值，并將其調(diào)至0.1用于后續(xù)試驗。當進行藥敏試驗時，根據(jù)藥敏反應(yīng)液終濃度，菌液稀釋調(diào)整為1×105CFU/mL～5×105CFU/mL，直接加入藥敏板。

1.2.2藥敏反應(yīng)板的制備

參照文獻［19-20］，采用倍比稀釋法，取無菌96孔細胞培養(yǎng)板，于每排1號孔加LB液體培養(yǎng)基100 μL作空白對照；2號孔分別加菌液和受試化合物溶液混合液200 μL；12號孔陰性對照孔不含藥物，只加菌液100 μL作陽性生長對照。3-11號孔各加新鮮配制的菌液100 μL；2-11號孔進行倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，各孔中DMSO含量均低于1%，各藥敏板于37℃恒溫箱培養(yǎng)。

1.2.3阪崎克羅諾桿菌最低抑菌濃度（MIC90值）的判定

參照文獻［19-20］測定阪崎克羅諾桿菌最低抑菌濃度（MIC90值）。將配制好的藥敏反應(yīng)板于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24 h，用酶標儀波長600 nm處測OD值。與陰性對照孔相比（只有菌生長不含藥液），以O(shè)D值下降90%以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC90（細菌生長90%被抑制時的藥物濃度）。當藥物的MIC90值超過測定濃度范圍時，按以下方法進行統(tǒng)計，MIC90值為最低濃度或在最低濃度以下時，不作區(qū)別，均計為“≤0.125 μg/mL”。上述實驗均平行操作3次，當MIC90值能準確重復或只差一個濃度時為止，并以較高濃度作為MIC90值。

1.2.4XTT法（XTT-reduction assay）

參照文獻［20］將XTT以飽和溶液的形式0.5 g/L保存在乳酸鹽林格液中，用0.22 μm的濾膜過濾除菌，分裝，-70℃保存；甲萘醌以100 mmol/L溶解于DMSO中，-20℃保存。在每次使用之前，取出凍存的XTT與甲萘醌，常溫自然溶解。XTT-甲萘醌混合溶液中XTT終濃度為0.5 mg/mL，甲萘醌終濃度為1 mmol/L。將100 μL配制好的XTT-甲萘醌溶液加入用PBS洗過的生物膜生長孔和對照孔中。將藥敏培養(yǎng)板于37℃避光培養(yǎng)90 min，用酶標儀波長490 nm處測定吸收度值。

1.2.5不同濃度鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌生物膜的作用分析

將菌懸液，接種至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1h，棄去上清，加入用新鮮的LB培養(yǎng)基配制的濃度為0、256、512、1 024、2 048 μg/mL的鹽酸小檗堿，另設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對照孔（未加藥的生物膜生長對照），37℃培養(yǎng)，24 h形成生物膜后，用PBS洗去未粘附細菌，加入XTT-甲萘醌溶液，將培養(yǎng)板37℃避光培養(yǎng)90 min，用酶標儀于波長490 nm處測定吸收度值。

1.2.6鹽酸小檗堿的加入時間對阪崎克羅諾桿菌生物膜影響

預粘附階段不加鹽酸小檗堿：將菌懸液，接種至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，PBS清洗，加入新鮮液體LB培養(yǎng)基，37℃分別培養(yǎng)0、1、3、5、7、12、24 h后，棄去上清，加入濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿（用新鮮液體LB培養(yǎng)基配制），另設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對照孔（未加藥的生物膜生長對照），24 h后XTT法測定生物膜的生長動力學。

預粘附階段加入鹽酸小檗堿：將濃度為1024μg/mL的鹽酸小檗堿和菌懸液同時接種至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃培養(yǎng)1 h，棄去上清，PBS清洗，加入新鮮液體LB培養(yǎng)基，37℃分別培養(yǎng)0、1、3、5、7、12、24 h后，棄去上清，加入濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿，設(shè)空白對照孔（只加培養(yǎng)基）與陰性對照孔（未加藥的生物膜生長對照）24 h后XTT法測定生物膜的生長動力學。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 for Windows軟件處理，對相關(guān)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌的MIC90

鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值為512 μg/mL，見圖1，多利培南對阪崎克羅諾桿菌MIC90值為0.25 μg/mL。

圖1　不同濃度鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌的抑制Fig.1Inhibition effect on C.sakazakii by different concentrations of berberine hydrochloride

2.2不同濃度鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的影響

將不同濃度的鹽酸小檗堿處理阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423，24 h后XTT法測定生物膜的生長動力學，結(jié)果表明，512 μg/mL至2048 μg/mL的鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率分別達到90%和80%，見圖2和圖3。

圖2　不同濃度鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜的影響Fig.2Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

圖3　不同濃度鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌IQCC10423生物膜的影響Fig.3Effect of berberine hydrochloride at different concentrations on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

2.3鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌粘附功能及其生物膜發(fā)展的影響

在阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423起始粘附1 h后，將1024 μg/mL鹽酸小檗堿加入生物膜形成的不同階段（0、1、3、5、7、12、24 h），24 h后XTT法測定生物膜的生長動力學。結(jié)果表明，3h加入鹽酸小檗堿后對兩個菌株生物膜形成的抑制率分別達到90.2%和78.1%，0 h時，對兩個菌株生物膜形成的抑制率分別為92.2%和86.6%。24 h時，對兩個菌株生物膜的抑制率分別為53.7%和47.6%。另一方面，起始粘附期間將1 024 μg/mL鹽酸小檗堿分別與BAA-894和IQCC10423共孵育1 h后，能夠降低菌株的粘附能力，7 h前加入鹽酸小檗堿可明顯抑制兩個菌株生物膜的形成能力，抑制率分別達到93%和92.5%，0 h時，對兩個菌株生物膜形成的抑制率分別為93.8%和93.4%。24 h時，對兩個菌株生物膜的抑制率分別為67.4%和59.2%，見圖4和圖5。

圖4　鹽酸小檗堿加入的不同時間對阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜形成的影響Fig.4Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii BAA-894 biofilm formation

圖5　鹽酸小檗堿加入的不同時間對阪崎克羅諾桿菌IQCC10423生物膜形成的影響Fig.5Effects of different addition time of berberine hydrochloride on C.sakazakii IQCC10423 biofilm formation

3　討論

鹽酸小檗堿是一種異喹啉類生物堿，對多種細菌具有較強的抑制作用［15-18］。Wang等［18］的研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿的濃度為15 μg/mL～30 μg/mL時，能夠抑制表皮葡萄球菌的代謝活性，當濃度為30 μg/mL～45 μg/mL時，能夠抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。Kim等［22］在研究中發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對金黃色葡萄球菌表面蛋白質(zhì)SortaseA的抑制效果明顯，并且對革蘭氏陽性菌的MIC為50 μg/mL～400 μg/mL。廖璞等［17］的研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以有效減弱表皮葡萄球菌生物被膜的形成。但是，目前對于使用鹽酸小檗堿抑制阪崎克羅諾桿菌生物膜形成的研究鮮有報道。

本試驗中采用多利培南作為陽性對照，證明試驗方法的有效性。由于多利培南是碳青酶烯類新廣譜抗生素，對腸桿菌科細菌具有較好的殺滅作用，Mendes等［21］的研究表明多利培南濃度為0.5 μg/mL時，能抑制98.7%的腸桿菌科分離菌株，并且對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和AmpC基因介導的β-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌株抑制率分別達到了94.3%和93.7%。因此，多利培南對于腸桿菌科的抗藥性細菌引起的感染疾病的治療是有臨床應(yīng)用價值的。多利培南對阪崎克羅諾桿菌MIC90值為0.25 μg/mL，鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌BAA-894和IQCC10423的MIC90值為512 μg/mL。

試驗中采用的XTT法，不會損害細菌生物膜的結(jié)構(gòu)，并且能檢測出生物膜中細菌細胞的代謝活性。由于以前的實驗已經(jīng)證明阪崎克羅諾桿菌IQCC10423比ATCC BAA-894的生物膜形成能力強，實驗結(jié)果表明前者對藥物的耐受性比后者強。鹽酸小檗堿濃度為1 024 μg/mL時對阪崎克羅諾桿菌BAA-894生物膜的抑制率為92.2%，而對IQCC10423生物膜抑制率為86.6%。這一結(jié)果表明，菌株的生物膜形成能力與其對藥物的抗性具有正相關(guān)性。

在阪崎克羅諾桿菌粘附功能及其生物膜形成的測定實驗中，加入1 024 μg/mL鹽酸小檗堿的時間階段不同，對阪崎克羅諾桿菌生物膜的抑制率不同。3 h前，加入鹽酸小檗堿可明顯抑制生物膜的形成，隨著阪崎克羅諾桿菌生物膜的成熟，在24小時時鹽酸小檗堿對BAA-894和IQCC10423生物膜的抑制率明顯下降。此外，1h起始粘附期間，BAA-894和IQCC10423分別與1 024 μg/mL鹽酸小檗堿共孵育后均降低了菌株的粘附能力，從而抑制了后續(xù)生物膜的生長與成熟。并且濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜具有部分清除作用。

此外，從食品中分離的阪崎克羅諾桿菌菌株已經(jīng)對一些抗生素或殺菌劑表現(xiàn)出了不同程度的抗性［9］。Müller等［23］的研究發(fā)現(xiàn)，阪崎克羅諾桿菌具有編碼β-內(nèi)酰胺酶的基因，從而對氨芐青霉素和頭孢菌素表現(xiàn)出了耐藥性。由于抗生素的濫用，導致致病菌耐藥性增加，傳統(tǒng)抗菌藥物的局限性日趨顯現(xiàn)，因此，尋找新的抗菌制劑以及研究其抗菌機理已經(jīng)成為亟待解決的問題。李立津等［24］和楊春梅等［25］的研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可消除細菌的耐藥質(zhì)粒。Severina等［26］在研究中發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠穿透金葡萄球菌細胞膜，是一種多藥耐藥泵作用物。由此可知，鹽酸小檗堿具有恢復細菌對其他抑菌藥物的敏感性的能力。由于細菌生物膜也與抗生素耐藥有關(guān)［27］。因此，鹽酸小檗堿對阪崎克羅諾桿菌生物膜抑制作用的研究是具有重要的現(xiàn)實意義。

4　結(jié)論

濃度為1 024 μg/mL的鹽酸小檗堿能夠部分清除阪崎克羅諾桿菌成熟的生物膜，并且能夠通過降低阪崎克羅諾桿菌的粘附能力而顯著抑制新生物膜的形成。這一結(jié)果表明，鹽酸小檗堿有可能作為抗菌劑用以控制阪崎克羅諾桿菌生物膜，從而減少其在食品加工環(huán)境的污染以及對人類的危害。

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In vitro Activity of Berberine Hydrochloride against Cronobacter sakazakii Biofilms

JING Chun-e，LI Ping，DU Xin-jun，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cronobacter sakazakii is an emerging pathogen which can form biofilms on the surfaces of equipment and processing environments.The biofilms of C.sakazakii are a potential source of contamination in food.In this study，the effect of berberine to inhibit C.sakazakii biofilm formation was investigated，which can help find antimicrobial substances from Chinese medical herbs to control its biofilms.The effect of berberine hydrochloride on the initial adhesion of C.sakazakii and its biofilm formation was evaluated by XTT reduction assay.The results revealed that the inhibition effect of berberine hydrochloride on C.sakazakii biofilms showed a dose dependent relationship and the MIC90of berberine hydrochloride against C.sakazakii was 512 μg/mL.Berberine hydrochloride at a concentration of 1 024 μg/mL could inhibit the early adherence of C.sakazakii，which suppressed the development of new biofilms.At this concentration，berberine hydrochloride could also partially destroy the mature biofilms.Therefore，berberine hydrochloride showed a great potential in prevention and control of biofilm formation of C.sakazakii and the biofilm-related infections caused by this pathogen.

Cronobactersakazaki；biofilm；berberinehydrochloride

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.033

2015-08-21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863）課題（2012AA101703）

景春娥（1985—），女（漢），博士研究生，研究方向：食品安全與檢測技術(shù)。

王碩（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品安全和免疫學檢測。