王榮秀，江麗娜，鄧威威*，張正竹

?

茶樹咖啡堿合成代謝中N-甲基轉移酶的研究進展

王榮秀，江麗娜，鄧威威*，張正竹

（安徽農業(yè)大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽合肥 230036）

咖啡堿是茶葉中的主要品質成分之一，是一種黃嘌呤生物堿化合物，約占茶葉干重的2%-5%。在茶樹中咖啡堿的核心合成途徑為：黃嘌呤核苷甲基化反應生成7-甲基黃嘌呤核苷，再通過脫核糖反應生成7-甲基黃嘌呤，然后經(jīng)過兩次甲基化依次生成可可堿和咖啡堿?？Х葔A合成途徑中轉甲基化反應是通過N-甲基轉移酶催化進行的，該酶是咖啡堿合成的關鍵酶。本文綜述了茶樹中N-甲基轉移酶的基因克隆、結構、功能分析及表達調控等方面的研究進展。

茶樹；咖啡堿；N-甲基轉移酶

咖啡堿是茶、咖啡和可可世界三大軟飲料植物中共有的重要功能性成分之一，同時也是茶樹中主要的生化活性物質，約占茶葉干重的2%-5%。19世紀20年代在咖啡和茶中發(fā)現(xiàn)并分離得到咖啡堿[1]，20世紀60年代以來對咖啡堿在茶樹中的代謝途徑研究有了很大的進展，其生物合成途徑也逐步的明晰起來。Ashihara等[2]用同位素示蹤法證明了茶樹中咖啡堿生物合成與茶樹的生長發(fā)育有著密切的關系?？Х葔A在生物體內的核心合成途徑為[3-4]：黃嘌呤核苷（Xanthosine，XR）甲基化反應生成7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine，7-mXR），再通過脫核糖反應生成7-甲基黃嘌呤（7-methylxanthine，7-MX），然后經(jīng)過兩次甲基化作用依次生成可可堿（Theobromine，Tb）和咖啡堿（Caffeine，Cf）。途徑中轉甲基化反應是通過N-甲基轉移酶（N-methyltransferases，NMTs）催化進行的，NMTs是茶樹咖啡堿合成的關鍵酶。2014年晏嫦妤[5]等綜述了植物中NMTs的酶學特性、克隆、基因結構及表達等，本文通過近年來學者的研究對茶樹NMTs基因克隆、結構、功能分析及表達調控等方面的深入研究，了解其分子機制，全面解析NMTs對茶樹咖啡堿生物合成的影響。

1茶樹中咖啡堿的概況

咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）是一種含氮化合物，茶樹中的生物堿以嘌呤堿為主體，而咖啡堿又是構成嘌呤堿的主體，因此咖啡堿在茶樹次生代謝中起到了舉足輕重的作用。自然界中富含咖啡堿的植物為數(shù)不多，茶樹就是其中的一個高等植物。茶樹中的咖啡堿分布與其他植物也略有不同，在其他植物中咖啡堿主要分布在果實和種子中，葉片中的含量極少。而茶樹中的咖啡堿除了種子外，在其他部位均有分布，其中以新梢嫩芽部位的含量最高，老葉和莖梗中次之，花和果實中最少，因此咖啡堿通常作為茶葉老嫩程度和判斷茶葉真?zhèn)蔚闹匾煞趾椭笜酥籟6]。此外，茶樹的品種，生長環(huán)境，栽培條件也是影響茶樹中咖啡堿含量的因素。20世紀80年代初發(fā)現(xiàn)了一種天然無咖啡堿茶葉——南昆山毛葉茶，其體內生物堿的組成以可可堿為主，而不是咖啡堿[7]。

咖啡堿不僅在植物體內能夠保護植物免受自然環(huán)境的傷害，促進植物的生長，同時也是一種普遍、有一定藥用價值的食物。適量的攝入咖啡堿可以健胃消食、利尿[8、9]、降低高血壓[10]、提高記憶力、抗癌[11]、降低II型糖尿病風險[12、13]等；但過量的攝入會引起失眠[14]、焦慮[15]、骨質疏松[16]和胎兒畸形[17、18]等。因此，如何調控茶樹中咖啡堿的合成對于茶樹資源的高效利用有著重大意義。

2茶樹中咖啡堿的合成途徑

植物中咖啡堿合成途徑大多是針對咖啡樹和茶樹的研究，但是在其他含有咖啡堿的植物中其合成的主要途徑是一致的[6]?？Х葔A的嘌呤環(huán)骨架來源于嘌呤核苷酸，在嘌呤甲基化過程中其甲基供體主要來自于S-腺苷甲硫氨酸，它是由甲硫氨酸與ATP作用轉化而來的。

`在茶樹中咖啡堿的合成途徑已經(jīng)基本研究清晰：主要分為核心途徑和供體途徑。核心途徑為腺嘌呤核苷酸途徑，其包括四個主要步驟（如圖中方框部分），(圖1)：經(jīng)過N-7、N-3、N-1位的三次甲基化反應和一步脫核苷反應[19-20]。在為核心途徑提供甲基的供體途徑中，合成黃嘌呤核苷有多種來源，已發(fā)現(xiàn)的有四條[20]：腺嘌呤核苷酸（AMP） 途徑，鳥嘌呤核苷酸（GMP） 途徑，嘌呤環(huán)從頭合成途徑，S-腺苷甲硫氨酸循環(huán)（SAM）途徑。其中，AMP途徑中，由于AMP 大量存在于植物細胞中，AMP成為咖啡堿合成最有效的前體[1，19-25]。此外，在茶樹植物體內還有其他合成咖啡堿的途徑，如茶葉堿通過補救途徑由3-甲基黃嘌呤、可可堿合成咖啡堿[26]。

3茶樹中NMTs基因的克隆

由于植物中嘌呤生物堿擁有多樣的代謝途徑，在一定的條件下它們也會相互轉化，因此，咖啡堿作為一種黃嘌呤生物堿化合物，在茶樹合成咖啡堿的途徑中，可能存在很多咖啡堿合成相關的NMTs基因。2000年，Kato[27]等從茶樹嫩葉中得到咖啡堿合成酶，并利用RACE技術從茶葉中克隆得到了TCS1（AB031280），其是催化咖啡堿生物合成后兩步甲基化反應的N（3、1）-甲基轉移酶基因，并通過體外酶活實驗證實了TCS1基因功能。根據(jù)TCS1基因序列，近年來從山茶屬中克隆出多個NMTs基因，許煜華[28]等和金基強[29]等研究表明茶樹中存在著與嘌呤堿合成相關的NMT基因家族，克隆出多個NMTS的gDNA序列。在NCBI中已登錄的茶樹咖啡堿合成相關的N-甲基轉移酶序列有大概20多個，此外還有部分序列尚未登陸NCBI。

圖1 茶樹中咖啡堿的合成途徑

隨著近年來對茶樹咖啡堿合成相關的N-甲基轉移酶研究逐步深入，在茶樹中克隆得到具有雙重催化活性的NMTs，可以催化N-3和N-1的甲基化反應[27，30]，同時在可可茶、滇緬茶等山茶屬植物中克隆得到具有催化N-3甲基化反應的NMTs。然而，在茶樹中催化咖啡堿合成的第一步甲基化的7-NMT未有報道，許多疑似具有N-7催化作用的NMTs序列，都證明沒有功能。此外，茶樹體內咖啡堿合成的主要途徑已經(jīng)研究透徹，但其次要代謝途徑研究并不完整，其相關酶的研究也較少。

4茶樹中NMTs的表達

咖啡堿一般在植物子葉、種子、幼葉中分布，在茶樹中咖啡堿不僅分布在這些部位，其生物活性也已在山茶屬植物的雄蕊、花瓣中發(fā)現(xiàn)，但是可可堿只發(fā)現(xiàn)在茶樹的雄蕊中[31]。眾多研究者通過實驗證明，茶樹中NMTs的表達量與咖啡堿的含量呈正相關，這一表達規(guī)律與咖啡相似，且茶樹中參與咖啡堿生物合成的主要三個NMTs在嫩葉、成熟葉片和老葉中的表達量與咖啡大體是一致的[32]。幼嫩組織中的表達量高于成熟組織，但是在不含嘌呤生物堿的山茶屬植物中NMTs在成熟葉片中的表達高于嫩葉[32，33]。通過研究者的實驗，生長周期和季節(jié)的變化對茶樹不同部位的NMTs的表達有一定的影響。Mohanpuria等[34]的研究發(fā)現(xiàn)茶樹中咖啡堿的合成和降解是發(fā)展變化的和受季節(jié)性調節(jié)，與休眠生長階段相比，咖啡堿合成酶在非休眠狀態(tài)下在頂端芽，第一葉，第二葉，幼莖的表達量比老葉低。陳麗萍[35]等采用Northern blot技術證明NMTs在不同品種茶樹中春、夏、秋3個季節(jié)都有表達，且同一季節(jié)不同品種之間NMTs的表達量無明顯差異。李金[36]等研究表明在茶樹秋季嫩葉中，TCS1表達量與咖啡堿含量顯著正相關，即TCS1表達量顯著影響咖啡堿的合成。Fujimori[37]等通過實驗表明四月份到六月份可可堿和咖啡堿在茶樹嫩芽中被檢測，但是沒有檢測到咖啡堿合成酶的活性。

此外，研究者通過改變外界條件和不同的脅迫處理方式來研究茶樹中是否受到其他因素的影響。Kato[38]等通過對離體茶樹枝條（20-30 cm）進行低溫處理、機械損傷和鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)對TCS基因表達沒有影響；對整株茶樹和離體的葉片都進行MeJA處理，TCS表達量都沒有變化；用重金屬處理茶樹葉片24小時后抑制了TCS的表達，但這種抑制對TCS基因表達不是特異性的，因為它同時抑制了茶樹咖啡堿合成其他相關基因的表達；茶樹葉片脫水處理后24小時TCS表達消失。此外，在對茶樹葉片分別進行蛋氨酸、谷氨酸和硝酸鈉處理2小時后TCS表達量高于對照組（水處理后的葉片）兩倍；在氯化銨和尿素處理后葉片中TCS表達水平略高于對照組（水處理后的葉片）。這極有可能是咖啡堿生物合成受下游氮代謝變化的調控，這就需要進一步明確咖啡堿代謝和氮代謝的關系。Shinozaki[39]等提出ABA缺少影響TCS的基因表達，表明ABA擁有獨立的通路參與TCS基因表達。Koshiishi[40]等研究表明，在光處理和暗處理下的茶樹葉片中都發(fā)生了咖啡堿生物合成且光照條件的改變對TCS基因的表達并沒有影響。后者可能是由于咖啡堿合成酶的活性與葉綠體有關[41]，因此光照條件的改變對TCS基因的表達并沒有影響。綜上所述，研究者對茶樹中影響NMTs表達因素做了大量的研究，如不同季節(jié)、不同組織部位、不同外界條件和脅迫作用，使得研究者了解NMTs的表達規(guī)律，從而進一步促進NMTs的表達調控研究，對調節(jié)茶樹中咖啡堿合成具有積極意義。

5茶樹中NMTs的活性和結構

茶樹咖啡堿合成酶的氨基酸序列及相關酶基因表現(xiàn)出高度的相似性且呈現(xiàn)出其底物特異性（見表1），將17條基因用MEGA軟件做系統(tǒng)發(fā)育樹分析（見圖2）后發(fā)現(xiàn)它們的相似度都在65%以上。茶樹中NMTs共有的高保守序列有：motif A（AA/VDLGCAAGP）， motif B’（VYLNDLF/PGNDFN），motif C（PGSFHGRLFP）和YFFF（AYLSQFHEDFTMFL）。甲基供體結合位點（SAM）有五個關鍵氨基酸殘基，這五個都有相同的motif A，B’和C保守區(qū)。實驗證明TCS1-5的gDNA序列均由4個外顯子和3個內含子組成[29]。三個保守區(qū)（motif A，B’和C）的編碼區(qū)域位于TCS1序列的第二段外顯子區(qū)。相對應的甲基黃嘌呤結合的氨基酸編碼區(qū)（在TCS1氨基酸序列中225，269，和318的位置）位于第三和第四段外顯子[42]。孔祥瑞[43]等采用生物信息學分析方法對植物咖啡堿合成酶的等電點、亞細胞定位、信號肽、跨膜螺旋、保守性功能結構域及基序、二級結構與三級結構等重要參數(shù)進行預測與分析。結果表明，植物咖啡堿合成酶主要定位于胞質和胞核中，含有磷酸化、酰基化和糖基化修飾位點。

圖2 山茶屬植物NMT蛋白序列的進化樹

表1 茶樹中NMTs的克隆及功能[5，43]

植物中參與咖啡堿生物合成相關的NMTs擁有不同的表達方式和轉錄水平，這些不同可能是由于多個原因導致的。2007年，Mccarthy[44]等實驗表明黃嘌呤核苷甲基轉移酶（XMT）中316位絲氨酸可能是底物黃嘌呤核苷的識別位點，XMT中161位谷氨酰胺到3,7-二甲黃嘌呤甲基轉移酶（DXMT）中160位組氨酸可能是催化的結果，266位苯丙氨酸到異亮氨酸的變化則對其辨別單甲基和二甲基轉移酶至關重要。

TCS1-6的核苷酸序列擁有很高的同源性（TCS6為假基因[29]），但是這些NMTs的啟動子核苷酸序列的相似度非常低[45]。Jin[40，42]等對不同茶樹品種5’-UTR區(qū)（ATG前252bp）堿基序列和其自然變異的等位基因TCS1a（TCS1，AB031280）（為對照組），TCS1b(ICS1，AB056108)，TCS1c(PCS1， AB207817)，TCS1d（KT215399），TCS1e（KT215397）和TCS1f（KT215398）進行研究。實驗結果表明TCS1d，e，f（包含關鍵氨基酸第225位和第269位）三個基因重組蛋白的咖啡堿合成酶活性都高于可可堿合成酶，TCS1bc的重組蛋白只有可可堿合成酶（TS）的活性，說明TCS1的自然變異改變了其活性和轉錄水平。同時，通過對定點突變實驗證明了TCS1 氨基酸殘基269位對TCS的活性和底物識別中起著重要的作用，但不能檢測底物的特異性[45]。此外，在低咖啡堿的茶種質資源中，TCS1等位基因轉錄水平低或其編碼的蛋白質只有TS活性這兩個分子機制控制著咖啡堿的生物合成，導致了咖啡堿的積累減少[45]。在不同的茶樹品種TCS1是多樣性的，這是個體樣本不同的遺傳背景的影響導致的。Jin[46]等對中國14個省選擇的44個擁有豐富遺傳背景的茶樹品種中，在其TCS1的外顯子區(qū)發(fā)現(xiàn)了31個SNPs。此外，對TCS1中的SNP4318進行位點突變（C/T）可顯著提高TCS1重組蛋白后可可堿合成酶（TS）和咖啡堿合成酶（CS）的活性，同時驗證了SNP4318和咖啡堿含量的關系。

綜上所述，眾多研究者希望明確決定NMTs活性的關鍵位點。目前大多數(shù)研究者用定點突變的方法來進行功能驗證（表2）。NMTs的結構與其活性關系的研究，將有助于我們對咖啡堿合成酶分子機制的明晰及高、低咖啡堿茶樹選育具有重要意義。

表2 定點突變研究NMTs的活性位點[5]

6展望

由于茶樹NMTs直接參與咖啡堿合成茶樹中與咖啡堿合成相關的NMTs基因的克隆、調控對培育高或低的咖啡堿茶樹品種有重要意義。余有本[47]等通過構建TCS1的植物表達載體，將TCS1轉入煙草發(fā)現(xiàn)TCS1在這些植株中均能表達。同時，通過提取轉基因植株中粗酶液進行體外酶促反應發(fā)現(xiàn)，TCS1能催化7-甲基黃嘌呤和可可堿生成咖啡堿，由此證明轉基因煙草植株中的TCSl具有催化活性。此外，張廣輝[48]等構建了TCS基因的RNA干涉載體，從而降低茶樹中的咖啡堿含量；一些研究者通過反義RNA等手段獲得低咖啡堿含量的茶樹品種。2016年，Jin[46]等通過分子標記輔助選擇（MAS）的方法為選擇高含量的咖啡堿茶樹品種提供了強大高效分子標記實驗基礎，為加快育種進程、提高效率和選擇精確提供策略。

根據(jù)已有報道，目前茶樹中NMTs的研究需要進一步深入，要進一步完善茶樹中NMT信息，了解NMTs在茶樹中的調控機制，為完善咖啡堿合成代謝途徑提供分子證據(jù)，從而實現(xiàn)茶樹咖啡堿的有效靶標。

[1] Ashihara H, Sano H, Crozier A. ChemInform Abstract: Caffeine and Related Purine Alkaloids: Biosynthesis, Catabolism, Function and Genetic Engineering [J]. Phytochemistry, 2008, 69(4):841-856.

[2] Ashihara H, Gillies F M, Crozier A. Metabolism of Caffeine and Related Purine Alkaloids in Leaves of Tea (L.)[J]. Plant & Cell Physiology, 1997, 38(4):413-419.

[3] Crozier A. Biosynthesis of Caffeine in Leaves of Coffee [J]. Plant Physiology, 1996, 111(3):747-753.

[4] Ashihara H. Purine metabolism and the biosynthesis of caffeine in maté leaves [J]. Phytochemistry, 1993, 33(6):1427-1430.

[5] 晏嫦妤, 任秋婧, 陳小芳,等. 咖啡堿合成N-甲基轉移酶研究進展[J]. 茶葉科學, 2014(6):531-540.

[6] 宛曉春，夏濤,等.茶樹次生代謝[M]. 北京：科學出版社，2015，5：5-7.

[7] 李斌, 鄭永球, 尹逸,等. 天然無咖啡堿茶葉資源的開發(fā)利用研究[J]. 食品科學, 2001, 22(7):33-35.

[8] Pare W. The effect of caffeine and seconal on a visual discrimination task [J]. Journal of Comparative & Physiological Psychology, 1961, 54(5):506-509.

[9] Brunyé T T, Mahoney C R, Lieberman H R, et al. Caffeine modulates attention network function [J]. Brain & Cognition, 2009, 72(2):181-8.

[10] Hartley T R, Sung B H, Pincomb G A, et al. Hypertension risk status and effect of caffeine on blood pressure.[J]. Hypertension, 2000, 36(1):137-41.

[11] Bode A M, Dong Z. The enigmatic effects of caffeine in cell cycle and cancer [J]. Cancer Letters, 2007, 247(1):26-39.

[12] 易超然, 衛(wèi)中慶. 咖啡因的藥理作用和應用[J]. 醫(yī)學研究生學報, 2005, 18(3):270-272.

[13] Mackenzie T, Comi R, Sluss P, et al. Metabolic and hormonal effects of caffeine: randomized, double-blind, placebo-controlled crossover trial [J]. Metabolism-clinical & Experimental, 2007, 56(12):1694-1698.

[14] Shilo L, Sabbah H, Hadari R, et al. The effects of coffee consumption on sleep and melatonin secretion [J]. Sleep Medicine, 2002, 3(3):271-273.

[15] Robertson D, Fr?lich J C, Carr R K, et al. Effects of Caffeine on Plasma Renin Activity, Catecholamines and Blood Pressure [J]. New England Journal of Medicine, 1978, 298(4):181-6.

[16] Montes F, Cabrera M A, Salgar C, et al. The role of potassium channels in the vasodilatory effect of caffeine in human internal mammary arteries [J]. Vascular Pharmacology, 2008, 50(3-4):132-6.

[17] Weng X, Odouli R, Li D K. Maternal caffeine consumption during pregnancy and the risk of miscarriage: a prospective cohort study [J]. American Journal of Obstetrics & Gynecology, 2008, 198(3):1-8.

[18] Heaney R P, Recker R R. Effects of nitrogen, phosphorus, and caffeine on calcium balance in women [J]. Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 1982, 99(1):46-55.

[19] Kato M, Mizuno K, Fujimura T, et al. Purification and characterization of caffeine synthase from tea leaves [J]. Plant Physiology, 1999, 120(2):579-86.

[20] Suzuki T, Ashihara H, Waller G R. Purine and purine alkaloid metabolism in, andplants [J]. Phytochemistry, 1992, 31(8):2575-2584.

[21] Negishi O, Ozawa T, Imagawa H. Biosynthesis of Caffeine from Purine Nucleotides in Tea Plant [J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 1992, 56(3):499-503.

[22] Stasolla C, Katahira R, Thorpe T A, et al. Purine and pyrimidine nucleotide metabolism in higher plants [J]. Journal of Plant Physiology, 2003, 160(11):1271-95.

[23] Negishi O, Ozawa T, Imagawa H. Guanosine Deaminase and Guanine Deaminase from Tea Leaves [J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2014, 58(7):1277-1281.

[25] Keya C A, Crozier A, Ashihara H. Inhibition of caffeine biosynthesis in tea () and coffee () plants by ribavirin [J]. Febs Letters, 2003, 554(3):473-7.

[26]謝果, 何蓉蓉, 栗原博. 茶葉生物堿的生物合成與代謝的研究進展[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2010, 8(2):153-160.

[27] Kato M, Mizuno K, Crozier A, et al. Plant biotechnology: Caffeine synthase gene from tea leaves [J]. Nature, 2000(6799):956-957.

[28] 許煜華, 文海濤, 趙亮,等. 英紅九號cDNA文庫的構建及NMT基因的篩選[C]// 中國農業(yè)工程學會農產品加工及貯藏工程分會學術年會暨華南地區(qū)農產品加工產學研研討會. 2010.

[29] 金基強, 姚明哲, 馬春雷,等. 合成茶樹咖啡堿相關的N-甲基轉移酶基因家族的克隆及序列分析[J]. 茶葉科學, 2014(2):188-194.

[30]Yoneyama N, Morimoto H, Ye C X, et al. Substrate specificity of N-methyltransferase involved in purine alkaloids synthesis is dependent upon one amino acid residue of the enzyme [J]. Molecular Genetics & Genomics, 2006, 275(275):125-35.

[31] Fujimori N, Ashihara H. Adenine metabolism and the synthesis of purine alkaloids in flowers of[J]. Phytochemistry, 1990, 29(11):3513-3516.

[32] 李葉云, 蘆原坦. 茶樹咖啡堿生物合成相關基因表達研究[C]// 2008茶學青年科學家論壇論文集. 2008.

當轉發(fā)模式為GSF時,雷區(qū)中心位置和比例因子均為空。當轉發(fā)模式為GSF時,需利用雷區(qū)轉發(fā)數(shù)據(jù)包,進而平衡網(wǎng)絡負載。因此,對凸包H進行相似變換,且從凸包H內隨機選擇中心位置,而比例因子ξ的定義如式(6)所示:

[33] Ishida M, Kitao N, Mizuno K, et al. Occurrence of theobromine synthase genes in purine alkaloid-free species of, plants [J]. Planta, 2009, 229(3):559-568.

[34]Mohanpuria P, Kumar V, Joshi R, et al. Caffeine biosynthesis and degradation in tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] is under developmental and seasonal regulation.[J]. Molecular Biotechnology, 2009, 43(2):104-11.

[35]陳麗萍. 南昆山毛葉茶等山茶屬植物N-甲基轉移酶基因克隆與表達研究[D]. 華南農業(yè)大學, 2006.

[36]李金, 魏艷麗, 龐磊,等. 茶樹咖啡堿合成途徑中TCS1、TIDH、SAMS的基因表達量差異及其與咖啡堿含量的相關性[J]. 江蘇農業(yè)科學, 2013(10):21-24.

[37] Fujimori N, Suzuki T, Ashihara H. Seasonal variations in biosynthetic capacity for the synthesis of caffeine in tea leaves [J]. Phytochemistry, 1991, 30(7):2245-2248.

[38] Kato M, Kitao N, Ishida M, et al. Expression for Caffeine Biosynthesis and Related Enzymes in[J]. Zeitschrift Fur Naturforschung C, 2010, 65(4):245-256.

[39] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Molecular responses to dehydration and low temperature: differences and cross-talk between two stress signaling pathways [J]. Current Opinion in Plant Biology, 2000, 3(3):217-223.

[40] Koshiishi C, Ito E, Kato A, et al. Purine Alkaloid Biosynthesis in Young Leaves of, in Light and Darkness[J]. Journal of Plant Research, 2000, 113(2):217-221.

[41] Kato A, Crozier A, Ashihara H. Subcellular localization of the-3 methyltransferase involved in caffeine biosynthesis in tea [J]. Phytochemistry, 1998, 48(5):777-779.

[42] Jin J Q, Yao M Z, Ma C L, et al. Natural allelic variations of TCS1 play a crucial role in caffeine biosynthesis of tea plant and its related species [J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2016, 100:18-26.

[43]孔祥瑞, 楊軍, 王讓劍. 植物咖啡堿合成酶的生物信息學分析[J]. 福建農業(yè)學報, 2014(12):1211-1218.

[44] Mccarthy A A, Mccarthy J G. The structure of two-methyltransferases from the caffeine biosynthetic pathway [J]. Plant Physiology, 2007, 144(2):879-89.

[45] Jin J, Yao M, Chunlei M A, et al. Cloning and Sequence Analysis of the-methyltransferase Gene Family Involving in Caffeine Biosynthesis of Tea Plant[J]. Journal of Tea Science, 2014, 34(2):188-194.

[46] Jin J Q, Yao M Z, Ma C L, et al. Association mapping of caffeine content with TCS1, in tea plant and its related specie [J]. Plant Physiology & Biochemistry, 2016, 105:251-259.

[47] 余有本, 江昌俊, 宛曉春,等. 茶樹咖啡堿合成酶基因cDNA在煙草中的表達[J]. 西北農林科技大學學報:自然科學版, 2007, 35(11):181-186.

[48] 張廣輝, 梁月榮, 陸建良,等. 茶樹咖啡因合成酶基因RNA干涉表達載體構建[J]. 茶葉科學, 2006, 26(4):243-248.

[49] Camellia sinensis TCSz Mrna for caffeine synthase, complete cds [DB]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB031281.

[50] Camellia sinensis caffeine synthase mRNA, complete cds[DB]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/AY907710.

[51] Camellia sinensis caffeine synthase gene, complete cds[DB]. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/No. EF526217.

[52] 李萌萌, 鄧威威, 金璐,等. 茶樹咖啡堿合成酶基因TCS1的定點突變及體外表達分析[C]// 中國科協(xié)年會——分12茶學青年科學家論壇. 2014.

（責任編輯：蔣文倩）

2016-09-06

S571.1

A

1006-5768（2016）04-0177-08