盧 晨，王亞飛，張 捷，閆書芹，張 強

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絲素蛋白微球的制備

盧 晨，王亞飛，張 捷，閆書芹，張 強*

（武漢紡織大學 紡織科學與工程學院，湖北 武漢 430073）

本文提供了一種快速有效制備微納米級絲素（SF）微球的方法。利用異丙醇使SF大分子迅速的β折疊化，再利用低溫凍-融技術使得SF大分子組裝成微納米級絲素微球。通過調(diào)控SF分子量控制的SF微球直徑及其分布，掃描電鏡表明SF微球基本呈球形；粒徑分析結(jié)果顯示，利用LiBr，90℃制備的絲素溶液較LiBr，60℃制備的絲素溶液成球直徑減小45.1%，約50~100nm；紅外表明SF微球大分子主要為β折疊結(jié)構(gòu)。通過這種方法可以高速有效的制備粒徑小且分布均勻的微納米級微球，使得SF微球在載藥方面更具有應用潛力。

絲素；微球；自組裝；分子量

1 前言

蠶絲作為一種天然蛋白質(zhì)纖維，具有優(yōu)異的機械性能、良好的生物相容性、生物降解性等。與其他高分子材料相比，作為天然高分子材料蠶絲絲素蛋白來源于生物體，其氨基酸序列中攜帶的部分生物信息可被細胞識別；絲素蛋白是由蠶的絹絲腺內(nèi)壁上的內(nèi)皮細胞分泌的高純度的蛋白質(zhì)，不含細胞器，與人類之間無病原微生物交叉感染的風險，生物安全性得到可靠保障；可被生物降解，最終產(chǎn)物為氨基酸或寡肽，易被機體吸收；可被溶解、純化后加工成多種形態(tài)的材料?；谏鲜鰞?yōu)點，絲素蛋白已被用于化妝品和食品添加劑約三十年，在手術縫合線領域也有近百年的使用歷史[1]。已開發(fā)的絲素蛋白創(chuàng)面保護膜具有良好的生物相容性[2]和促創(chuàng)面重建的活性，并改進了其可縫合性能[3]。在藥物緩釋和再生醫(yī)學微納載體領域，絲素蛋白微球與部分細胞、機體組織具有特殊的親和性，能夠?qū)⑺d藥物在靶區(qū)集中，從而實現(xiàn)對機體病灶的靶向治療[4]，表現(xiàn)出了極大的應用潛力和市場前景。因此，絲素蛋白緩釋微球制備、結(jié)構(gòu)、性能和應用，已成為當前醫(yī)藥制劑和再生醫(yī)學領域的研究熱點和重點。

自組裝是指具有納米尺度的微粒子能夠自發(fā)形成規(guī)則結(jié)構(gòu)的過程。蛋白質(zhì)和多肽等物質(zhì)自組裝主要是依靠氫鍵、靜電相互作用力和疏水作用等次價鍵作用力來實現(xiàn)的。SHI 等[5]采用自組裝的方法制備了平均直徑為980 nm的絲素微球，先利用乙醇誘導形成納米顆粒，再將其加入到聚乙烯醇（PVA） 溶液中，冷凍24 h，然后通過吸附作用裝載藥物。CHEN 等[6]將模型藥物PTX）溶解在乙醇中，然后與絲素溶液混合，然后在-20 ℃的條件下冷凍24 h，通過自組裝制備裝載藥物的絲素微球。CAO等[7]在使絲素蛋白溶液在乙醇和冷凍的協(xié)同作用下，自組裝形成納米級微球。朱等[8]人利用冷凍剪切自組裝法，在不添加任何有毒化學交聯(lián)劑的情況下制備了粒徑為1-5 μm的絲素微球。黃等[9]利用絲素納米微球作為模板，利用自組裝和電場調(diào)控的方法獲得了直徑在10-2000 nm的碳酸鈣微球，在整個微球制備的過程中沒有添加任何的有毒的化學試劑，完全滿足在化妝、涂料、載藥材料等方面的要求。CHENG等[10]利用自組裝法制備絲素微球，并將微球與氯仿溶液共同制備成微膠囊，該微膠囊尺寸可控，可滲透性好，是一種極具潛力的藥物載體。王等[11]利用冷凍干燥法制備呈圓形、粒徑在300-900 nm、載藥率為4.5 %左右的絲素蛋白(SF)/重組人骨形成蛋白2 (rhBMP-2)緩釋微球；研究表明當SF與交聯(lián)劑比例、rhBMP-2與SF質(zhì)量比均會對微球的粒徑和載藥率有一定的影響。吉等[12]利用自組裝制備了粒徑為210-320 nm，分散指數(shù)為0.17左右、呈圓形、包封率及載藥質(zhì)量分數(shù)分別可達40.27 %及1.22 %載有姜黃素的絲素蛋白微球，且研究表明隨著絲素蛋白質(zhì)量分數(shù)增加，載藥微球粒徑增大；而姜黃素初始質(zhì)量濃度的增大，可使微球粒徑略有減小。

自組裝法制備微球生產(chǎn)工藝簡單，反應條件溫和、產(chǎn)量高、不引入有害溶劑，并可以實現(xiàn)親水性或疏水性兩種藥物的負載，應用前景廣泛，但是微球的尺寸及其分散性還有待優(yōu)化。本研究著眼于充分利用自組裝法制備絲素微球的優(yōu)點，同時通過采取不同的方法制備絲素溶液獲取不同分子量的絲素蛋白大分子，來實現(xiàn)平均粒徑小且粒徑分布寬度較窄、分散性較好的絲素微球的制備。

2 實驗儀器和實驗材料

2.1 實驗儀器

電子天平、電磁爐、電熱恒溫鼓風干燥箱、磁力恒溫攪拌器、循環(huán)水式真空泵、冰箱、透析袋、傅立葉變換紅外光譜儀、掃描電子顯微鏡、粒徑分析儀、冷凍干燥機、錐形瓶、燒杯、玻璃棒、紗布、磁力攪拌轉(zhuǎn)子等。

2.2 實驗材料和藥品

蠶絲、異丙醇、溴化鋰、氯化鈣、乙醇、去離子水等。

3 絲素微球的制備

3.1 家蠶絲素纖維脫膠

將家蠶絲放入濃度為0.06%的碳酸鈉溶液中以浴比1:50進行脫膠，在98~100℃的條件下處理三次，前兩次用自來水脫膠30min，并清洗干凈；第三次用去離子水脫膠45min，并用去離子水洗凈。然后扯松在55℃烘箱里烘干得到的精煉蠶絲備用。

3.2 家蠶絲素纖維溶解

（1）將脫膠的絲素纖維按浴比1:4加入9 M的LiBr溶液中，于60士2 ℃條件下攪拌溶解2h得到絲素蛋白混合溶液。

（2）將脫膠的絲素纖維按浴比1:4加入9 M的LiBr水溶液中，于100士2 ℃條件下攪拌溶解2h得到絲素蛋白混合溶液。

（3）將脫膠的絲素纖維按浴比1:5加入氯化鈣：乙醇：水摩爾比為1:2:8 的三元溶液中，于72士2 ℃條件下攪拌溶解1 h得到絲素蛋白混合溶液。

（4）將脫膠的絲素纖維按浴比1:5加入氯化鈣：乙醇：水摩爾比為1:2:8 的三元溶液中，于100士2 ℃條件下攪拌溶解1h得到絲素蛋白混合溶液。

3.3 家蠶絲素溶液的透析

將溶解制備的家蠶絲素蛋白混合溶液分別裝入透析袋中(截留分子量為8000~14000Da)，用去離子水透析4天，期間每2小時換一次水，以除去LiBr、CaCl2等雜質(zhì)。經(jīng)透析得到的家蠶絲素蛋白溶液經(jīng)紗布過濾離心裝入試劑瓶中保存于4℃冰箱中冷藏備用。

3.4 家蠶絲素溶液濃度測定

將3個鋁金屬表面皿編號放入105℃烘箱中1h，取出稱重得到皿重W(g)，在表面皿內(nèi)各用移液槍各取1ml的家蠶絲素蛋白溶液倒入后稱重Wl(g)，放入烘箱4 h后取出稱重，以后每隔20 min稱重一次，直到重量不再變化時記下數(shù)據(jù)為W2(g)。依據(jù)式(1)計算得到家蠶絲素蛋白溶液的濃度C(％)；然后求取濃度平均值，即為所求絲素溶液質(zhì)量百分數(shù)。

剛透析出來的家蠶絲素蛋白溶液的濃度約為4 wt％。

3.5 絲素蛋白微球的制備

將采取不同方法制備的新鮮絲素溶液稀釋到1wt%備用。將異丙醇和稀釋的新鮮制備的絲素溶液按照體積為1:5混合，在37℃條件下均勻攪拌5min，待冷卻放入-20℃條件下冷凍24h，再取出在室溫條件下解凍便可獲得微球。

4 絲素微球性能的測試

4.1 掃描電鏡絲素微球表面形態(tài)觀察

利用掃面電鏡對微球形態(tài)進行觀察，并初步分析其直徑大小。實驗結(jié)果表明，在絲素溶液濃度相同、采取相同的絲素微制備方法的條件下，絲素微球的形態(tài)基本是呈球形，與此同時實驗結(jié)果表明微球粒徑與絲素溶液的制備方法有明顯的關系。在相同的條件下，利用三元溶液在100℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球較利用三元溶液在72℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑要小；與此同時，利用溴化鋰溶液在90℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球較利用溴化鋰溶液在60℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑要小。由此表明，制備絲素溶液的條件相對比較烈，獲取的絲素大分子的斷裂程度會相對較高，獲取的絲素大分子的相對分子質(zhì)量可能較小，從而進一步影響微球的直徑和直徑分布。

圖1 絲素微球的幾種形態(tài)

其中：圖1（a）是采用三元溶液在72℃條件下制備的濃度為1wt%的絲素溶液制備的絲素微球；圖1（b）是采用三元溶液在100℃條件下制備的濃度為1wt%的絲素溶液制備的絲素微球；圖1（c）是采用溴化鋰溶液在60℃條件下制備的濃度為1wt%的絲素溶液制備的絲素微球；圖1（d）是采用溴化鋰溶液在90℃條件下制備的濃度為1wt%的絲素溶液制備的絲素微球。

4.2 粒徑分析

利用SmileView軟件分析，得到利用不同方法制備的絲素溶液所制備的絲素微球的平均粒徑和粒徑分布情況。

利用三元溶液在72℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑在100~250nm之間，平均粒徑為179.3nm；利用三元溶液在100℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑在60~120nm之間，且粒徑在80nm左右的微球占大部分，平均粒徑為101.7nm；利用溴化鋰溶液在60℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑在100~300nm之間，且大部分粒徑在150~200nm之間平均粒徑為157.6nm；利用溴化鋰溶液在90℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球粒徑在50~100nm之間，且大部分粒徑在70nm，平均粒徑為86.5nm。結(jié)果表明，采用不同的方法制備的絲素溶液對最終形成的絲素微球的直徑及其分布有著明顯的關系。三元溶液在100℃條件制備的絲素溶液制備的絲素微球的粒徑分布寬度和平均粒徑大小較72℃明顯要?。煌瑯?，溴化鋰溶液在90℃條件制備的絲素溶液制備的絲素微球的粒徑分布寬度和平均粒徑大小較60℃明顯要小。初步猜想為制備絲素溶液的條件的劇烈程度對獲取的絲素的大分子的相對分子質(zhì)量及其分布寬度有一定的影響，從而進一步控制所制備的絲素微球的粒徑及其分布寬度。

圖2 不同條件下制備的絲素溶液的平均粒徑

4.3 紅外分析

利用傅立葉紅外光譜分析儀對微球內(nèi)部結(jié)構(gòu)進行分析。在絲素的紅外吸收光譜上，SilkⅠ的吸收峰出現(xiàn)在1650～1655 cm-1(酰胺Ⅰ)，1525～1540 cm- 1(酰胺Ⅱ)，1266 cm- 1(酰胺Ⅲ)，669 cm- 1(酰胺Ⅴ)附近。SilkⅡ的吸收峰出現(xiàn)在1620～1635 cm- 1(酰胺Ⅰ)，1531 cm- 1(酰胺Ⅱ) ，1230～1235 cm- 1(酰胺Ⅲ )，695 cm- 1(酰胺Ⅴ ) 附近。無規(guī)卷曲的吸收峰出現(xiàn)在：1655～1660 cm- 1，1535～1545 cm- 1，1235 cm- 1，650 cm-1，而新鮮制備的絲素蛋白主要是不穩(wěn)定的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[12]。紅外結(jié)果表明，無論是采取何種絲素溶液制備的絲素微球，其紅外吸收峰值基本是一致的。均在1650cm- 1和1535cm- 1處出現(xiàn)明顯的紅外吸收峰。而其中1650cm-1是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，1535cm- 1是β-折疊結(jié)構(gòu)的特征吸收峰。這一結(jié)果表明，絲素微球中的絲素蛋白結(jié)構(gòu)存在部分β折疊化，形成了穩(wěn)定的β折疊結(jié)構(gòu)；與此同時也存在相對亞穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)。

圖3 絲素微球紅外光譜

其中：圖3（a）是溴化鋰溶液在90℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球；圖3（b）是三元溶液在100℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球；圖3（c）是三元溶液在72℃條件下溶解的絲素溶液制的絲素微球；圖3（d）是溴化鋰溶液在60℃條件下溶解的絲素溶液制備的絲素微球。

5 結(jié)論

本文主要是通過采取利用不同的方法溶解的絲素溶液來制備絲素微球，探討了各種絲素溶液對制備的絲素微球的粒徑大小及其分布的影響。本文可以得出初步結(jié)論：采用相對較為劇烈的方式獲取的絲素溶液制備的絲素微球可以使得制備的絲素微球粒徑和粒徑分布寬度都相對減?。徊⑶覍嶒灡砻?，利用三元溶液在100℃條件下溶解的絲素溶液和利用溴化鋰溶液在90℃條件下溶解的絲素溶液可以成功制備納米級絲素微球，且微球的分布寬度較窄。采用這一方法可以快速有效的制備微納米級絲素微球，這使得絲素蛋白微球在載藥方面的應用更加具有前景。

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The Preparation of Silk Fibroin Microsopheres

LU Chen, WANG Ya-fei, ZHANG Jie, YAN Shu-qin, ZHANG Qiang

(School of Textiles Science and Engineering, Wuhan Textile University,Wuhan Hubei 430073, China )

In this study, a quickly and effectively method to prepare well dispersivity micro-sopheres has been reported. The isopropyl alcohol has been used to process the fresh silk fibroin solution which can induce the formation of β-sheets from random coil structure quickly, then the process of freezing has been used to lead the self-assembly of the β-sheets silk fibroin macromolecules. The size and dispersvity of silk fibroin micro-spheres diameter were controlled through different methods of preparing silk fibroin solution which would result in different molecular weight of silk fibroin macromolecules. The surface features were determined by Scanning Electron Microscopy(SEM), the result indicated that the silk fibrion micro-sopheres is spherical; The size and dispersvity of silk fibroin micro-spheres diameter were determined by Smile View,the result suggested that the diameter of silk fibroin micro-spheres prepared from the silk fibrion solution which were prepared in LiBr solution at 90 oC decresed by 45.1% compared to at 60 oC; the molecule structure of silk fibroin microsphere were determined by Infrared Spectroscopy(FTIR ),the result suggested that the structure of silk fobroin molecule of micro-sopheres has changed to β-fold sheet or α-helix structure. In this way, the micro and nano sopheres can be prepared quickly and effectively which will largely broaden the application of silk fibroin sopheres.

silk fibroin; micro-sophere；self-assembly；molecular weight

TS201.1

A

2095－414X(2016)06－0003－05

張強（1982-），男，副教授，研究方向：紡織材料.

國家自然科學基金項目（51303141；51403163），湖北省教育廳重點項目（N154004）