杜勝陽，王斌斌，馮佳，侯斌曉，喬建軍

(天津大學(xué) 化工學(xué)院制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072)

?

乳酸菌基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展

杜勝陽，王斌斌，馮佳，侯斌曉，喬建軍*

(天津大學(xué) 化工學(xué)院制藥工程系，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300072)

乳酸菌是革蘭氏陽性菌，廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)及飼料工業(yè)等行業(yè)。對乳酸菌進(jìn)行遺傳操作是調(diào)節(jié)、優(yōu)化其代謝途徑的基礎(chǔ)。通過基因敲除技術(shù)改造乳酸菌基因組，可以判斷基因組中未知基因所編碼產(chǎn)物的功能，有目的、有選擇地使乳酸菌生產(chǎn)有益的異源基因產(chǎn)物。基因敲除技術(shù)已成為當(dāng)前乳酸菌分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。文中對幾種乳酸菌基因敲除策略研究進(jìn)展及影響敲除效率的因素進(jìn)行了綜述，分析存在的問題并初步探討展望了乳酸菌敲除技術(shù)的未來發(fā)展趨勢。

基因敲除；乳酸菌；同源重組；單鏈重組；敲除效率

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類能發(fā)酵碳水化合物且主要產(chǎn)物為乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的通稱。目前至少分為18個(gè)屬，包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。乳酸菌代謝相對簡單，具有很好的生物安全性，是公認(rèn)的安全級微生物(generally recognized as safe, GRAS)，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)及飼料工業(yè)等行業(yè)[1]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因測序技術(shù)的改革，以及后基因組時(shí)代的到來，人們已經(jīng)完成了對多種乳酸菌基因組的測序，從基因水平上更加清楚地認(rèn)識、了解它的代謝規(guī)律。乳酸菌基因組中含有大量非必需基因，包括次級代謝產(chǎn)物基因簇、插入序列、冗余序列等。敲除這些非必需基因，可以改造得到最小化基因組的乳酸菌。

隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，微生物基因組簡化成為研究熱點(diǎn)[2]。乳酸菌的基因組簡化后，能優(yōu)化其代謝網(wǎng)絡(luò)，減少副產(chǎn)物，提高了對底物和能量的利用效率，提升代謝網(wǎng)絡(luò)的可控制性以及產(chǎn)物的可預(yù)測性。目前，基因組簡化的研究在大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等模式微生物中已相繼被報(bào)道[3-5]。其中，對大腸桿菌基因敲除系統(tǒng)的研究比較成熟，如高效的Red/ET重組系統(tǒng)。然而基因組簡化的研究在乳酸菌中尚不成熟，更高效的基因敲除系統(tǒng)有待探究。目前，大部分乳酸菌基因敲除技術(shù)還是依賴于傳統(tǒng)的同源重組雙交換方法。本文就近年來乳酸菌基因敲除技術(shù)取得的進(jìn)展進(jìn)行綜述，并探討了影響敲除效率的有關(guān)因素，旨在為今后的深入研究提供有價(jià)值的參考。

1　乳酸菌基因敲除原理概述

基因敲除技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，其原理是利用特定方法使目標(biāo)基因失活或者缺失，對染色體進(jìn)行定點(diǎn)修飾改造，從而改變細(xì)胞的遺傳特性。運(yùn)用基因敲除技術(shù)，可以改變?nèi)樗峋拇x流向，阻斷不必要次級代謝產(chǎn)物的積累，降低發(fā)酵成本，大幅度提高目的產(chǎn)物的生產(chǎn)水平及純度。另外，基因敲除技術(shù)還可用于乳酸菌基因結(jié)構(gòu)與功能研究[6]。

經(jīng)典基因敲除技術(shù)的理論依據(jù)是同源重組。同源重組依賴于基因同源序列的聯(lián)會，DNA分子間或者分子內(nèi)交換對等的部分，發(fā)生重新組合。根據(jù)同源重組原理，合理設(shè)計(jì)并通過酶切連接、融合PCR構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的重組載體，然后將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對宿主染色體DNA序列的插入、缺失或者置換突變。乳酸菌中的同源重組是個(gè)復(fù)雜的過程，通常分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會體階段、聯(lián)會體形成階段和Holiday 結(jié)構(gòu)(Holiday Juncture Structure)的拆分階段，期間需要RecA、RecBCD、RecF、RecR、RuvAB等重要蛋白參與。

另外，還可以依據(jù)位點(diǎn)特異性重組對乳酸菌進(jìn)行基因敲除。它的原理是在重組酶催化下，含有特異位點(diǎn)的兩條DNA鏈會發(fā)生重組。依據(jù)特異位點(diǎn)的序列和排列方向，重組以后可能出現(xiàn)3種結(jié)果：整合(integration)、切除(excision)、倒位(inversion)[7]。

位點(diǎn)特異性重組酶主要包括兩大家族，分別為整合酶系和解離酶系。整合酶家族有兩個(gè)代表性的重組酶系統(tǒng)分別是Cre/loxP、FLP/FRT重組酶系統(tǒng)。解離酶家族中，常用于乳酸菌的重組酶是lactococcal噬菌體的TP901-1整合酶，它能夠特異性介導(dǎo)attP位點(diǎn)與attB位點(diǎn)間的重組反應(yīng)。

2　乳酸菌基因敲除策略

乳酸菌中的基因敲除大致可以分為3類：同源單雙交換基因敲除、位點(diǎn)特異性重組、線形DNA重組基因敲除。

2.1利用同源重組單交換雙交換進(jìn)行敲除

同源重組單雙交換的首要條件是構(gòu)建重組載體，運(yùn)用PCR將目標(biāo)基因上游以及下游片段或者不完整的靶基因擴(kuò)增出來，連接到敲除載體上，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞，發(fā)生一次或兩次同源重組，以敲除或者破壞基因。

在對目標(biāo)基因進(jìn)行敲除過程中，只發(fā)生一次同源重組，稱為同源單交換，如圖1所示。單交換操作簡單、易行，重組發(fā)生后整個(gè)質(zhì)粒載體整合進(jìn)入目標(biāo)基因內(nèi)部，使目標(biāo)基因失活。LEENHOUTS等[8-9]稱之為Campbell型整合，在乳酸乳球菌中可通過Campbell型質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除。在對瑞士乳桿菌和戊糖乳桿菌的相關(guān)研究中也有單交換失活基因的報(bào)道[10-11]。

PTB-部分目標(biāo)基因圖1　單交換敲除策略示意圖[12]Fig.1　Gene knockout by homologous single crossover

同源重組雙交換就是發(fā)生兩次同源重組，在單交換的基礎(chǔ)上再進(jìn)行一次交換，它分為缺失型突變和插入型突變。通過缺失型突變可以做到無痕敲除，而插入型突變是將目標(biāo)基因內(nèi)部插入新的基因序列，使基因失活。除了得到突變型菌株，同源雙交換后，還會產(chǎn)生回復(fù)突變得到野生型菌株，如圖2和圖3所示。

AG-抗性基因；L-左同源臂；R-右同源臂圖2　雙交換插入型敲除策略示意圖Fig.2　Inserted knockout by homologous double crossover

CG-反向篩選標(biāo)記圖3　雙交換缺失型敲除策略示意圖Fig.3　Markerless knockout by homologous double crossover

早在1996年FERAIN等[13]就運(yùn)用這種經(jīng)典的基因敲除方法，利用不能在乳酸菌中復(fù)制的pJDC9質(zhì)粒構(gòu)建重組載體，對植物乳桿菌染色體上的乳酸脫氫酶L-Idh和D-Idh進(jìn)行敲除，研究了這兩個(gè)基因?qū)?xì)胞壁合成的影響。在FERAIN的研究基礎(chǔ)上，LIU[14]在2006年對植物乳桿菌TF103再次進(jìn)行了敲除，利用載體pBluescript構(gòu)建得到敲除載體，通過同源雙交換成功敲除基因als，阻斷了丙酮酸到乙酰乳酸的代謝通路，促進(jìn)了乙醇和甘露醇的生成。2014年JIN等[15]構(gòu)建了隔離不穩(wěn)定的敲除載體pCBM32-DSUDs，轉(zhuǎn)化進(jìn)檸檬明串珠菌中，兩次同源重組后，成功把氯霉素基因插入右旋糖酐蔗糖酶基因(dsrC)中。失活dsrC基因的檸檬明串珠菌喪失了合成右旋糖酐的功能，不再具有粘性缺點(diǎn)。研究同時(shí)證明了dsrC在蔗糖分解代謝中的重要作用。

同源重組單雙交換技術(shù)是經(jīng)典的基因敲除方法，具有很長的應(yīng)用歷史。理論成熟、操作簡單，至今仍有較多的學(xué)者在研究乳酸菌同源整合載體的構(gòu)建及鑒定[16-17]。但是這種方法工作量大，敲除效率不高，容易產(chǎn)生回復(fù)突變，在革蘭氏陽性菌中應(yīng)用此技術(shù)進(jìn)行基因敲除效率較低。

2.2位點(diǎn)特異性重組敲除

近年來，利用位點(diǎn)特異性重組(site-specific recombination)的基因打靶技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用[18]。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由重組酶和特異性識別位點(diǎn)兩部分構(gòu)成，重組酶只能識別催化特異性位點(diǎn)間的重組，所以該反應(yīng)具有高度的專一性和保守性。目前常用于乳酸菌中的位點(diǎn)特異性系統(tǒng)是Cre/loxP系統(tǒng)和TP901-1/att重組系統(tǒng)。

2.2.1Cre/loxP系統(tǒng)

Cre重組酶是位點(diǎn)特異性重組酶家族中的一員，分子質(zhì)量為38 kDa，能特異性識別DNA序列上的loxP位點(diǎn)。該位點(diǎn)有34個(gè)堿基組成，其中包括兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)順序和8bp的間隔區(qū)域。Cre/loxP系統(tǒng)主要應(yīng)用于基因失活或缺失、基因激活、基因易位等，除此之外還可以用于載體的構(gòu)建。

菌株遺傳穩(wěn)定性是進(jìn)行遺傳操作時(shí)需考慮的一個(gè)關(guān)鍵因素?；蚯贸呗灾谐Ｒ脒x擇標(biāo)記基因，從而利于篩選正確的突變體。但如果殘留標(biāo)記基因，可能導(dǎo)致菌體生長遲緩，而且標(biāo)記基因的表達(dá)可能對上下游基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。因此，在乳酸菌中常用Cre/loxP系統(tǒng)消除基因組上的標(biāo)記基因。

Cre/loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的重組發(fā)生后，會在基因組中殘留一個(gè)loxP位點(diǎn)，當(dāng)再利用該系統(tǒng)時(shí)，會產(chǎn)生不必要的突變。因此，后來發(fā)展了一種可以產(chǎn)生穩(wěn)定迭代重組的突變loxP系統(tǒng)——lox66×lox71Cre系統(tǒng)。當(dāng)突變的lox66和lox71位點(diǎn)發(fā)生重組時(shí)，會產(chǎn)生一個(gè)退化的lox72位點(diǎn)，該位點(diǎn)不能被Cre酶識別。2007年Michiel等[19]在傳統(tǒng)敲除的基礎(chǔ)上引入Cre/loxP系統(tǒng)，并使用突變的lox66×lox71位點(diǎn)，成功實(shí)現(xiàn)了植物乳桿菌多基因敲除以及篩選標(biāo)記消除。2014年在Michiel工作的基礎(chǔ)上，QIAO等[20]把非復(fù)制型質(zhì)粒pNZ5319轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸乳球菌進(jìn)行同源重組雙交換，然后引入Cre/loxP系統(tǒng)消除篩選標(biāo)記氯霉素，成功敲除乳酸乳球菌NZ9000胸腺嘧啶合成酶基因thyA，獲得了食品級篩選標(biāo)記菌株。所以用Cre/loxP系統(tǒng)從基因組上消除標(biāo)記基因是一種簡潔、有效的方法。

2.2.2TP901-1/att重組酶系統(tǒng)

TP901-1/att重組酶系統(tǒng)是一種能產(chǎn)生穩(wěn)定單拷貝進(jìn)行染色體整合的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，產(chǎn)生的TP901-1整合酶，會促使兩個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)高頻率重組。這兩個(gè)不一樣的結(jié)合位點(diǎn)attB(43bp)和attP(56bp)，分別存在于乳酸乳球菌染色體上和構(gòu)建的整合質(zhì)粒上[21]。當(dāng)整合載體和基因組整合完成后，載體的兩側(cè)會產(chǎn)生兩個(gè)雜合的位點(diǎn)attL和attR，如圖4(B)所示。盡管該系統(tǒng)具有高效性，但仍存在一些缺點(diǎn)，例如作為篩選標(biāo)記的抗生素抗性基因殘留在染色體上，迭代整合無法完成等。根據(jù)attB和attP位置、排列方向的不同，重組后還會產(chǎn)生敲除和倒位的結(jié)果。類似于Cre/loxP系統(tǒng)在乳酸菌中的應(yīng)用，TP901-1/att重組酶系統(tǒng)能消除基因組上的標(biāo)記基因。結(jié)合單交換敲除原理，利用同向的attB和attP，共同敲除目標(biāo)基因，如圖4(A)所示。

圖A-基因敲除；圖B-基因整合圖4　TP901-1/att重組系統(tǒng)基本原理Fig.4　The site-specific recombination about TP901-1/att

2013年P(guān)etersen等[22]構(gòu)建了一種可以重復(fù)迭代整合，無標(biāo)記的特異位點(diǎn)整合技術(shù)。通過構(gòu)建含有噬菌體結(jié)合位點(diǎn)attP的非復(fù)制型整合載體pKV6，實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性打靶。該載體上含有一個(gè)最小的細(xì)菌結(jié)合位點(diǎn)attBmin、一個(gè)負(fù)篩選標(biāo)記oroP以及兩個(gè)用來去除抗性篩選標(biāo)記的突變lox66×lox71位點(diǎn)。當(dāng)轉(zhuǎn)入的噬菌體TP901-1整合酶表達(dá)時(shí)，pKV6會高效的整合進(jìn)入乳酸菌染色體，通過表達(dá)Cre酶，和負(fù)篩選標(biāo)簽篩選得到loxP重組體。而引入的最小結(jié)合位點(diǎn)attBmin，能夠使后續(xù)的第二輪的整合成功進(jìn)行。利用這個(gè)工具系統(tǒng)，Petersen等成功把木糖相關(guān)基因xylABR和xylT整合進(jìn)入乳酸乳球菌KF147中，使其能夠利用木糖作為碳源。

2.3線形轉(zhuǎn)化敲除法

線形轉(zhuǎn)化敲除是把線性DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，是近年來基因敲除方法的熱點(diǎn)之一。最為人所熟知的是Red/ET重組系統(tǒng)，常應(yīng)用于大腸桿菌中。它主要利用λ噬菌體Red蛋白組合(Redα/Redβ/Redγ)和Rec噬菌體誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白RecE和RecT[23]。與同源雙交換相比，該方法所需的同源臂僅為35～50 bp、重組效率更高。但是它主要用于革蘭氏陰性菌中，鮮有報(bào)道把這個(gè)系統(tǒng)應(yīng)用于乳酸菌中。

目前，能運(yùn)用于乳酸菌中的線形敲除技術(shù)是單鏈重組工程(Single strand DNA Recombination-SSDR)。它通過誘導(dǎo)表達(dá)Red/ET重組系統(tǒng)中的Redβ或者RecT重組酶，把單鏈核苷酸整合到細(xì)菌染色體中，如圖5所示。

深灰色的點(diǎn)-抗性基因；灰色橢圓-菌體細(xì)胞；R-重組酶基因；EP：表達(dá)RecT或Redβ的質(zhì)粒；Ss DNA-單鏈DNA圖5　單鏈重組工程示意圖Fig.5　Single strand DNA Recombination

Redβ和RecT表達(dá)單鏈DNA結(jié)合蛋白，常被作為重組酶，能促進(jìn)互補(bǔ)DNA鏈的退火。2012年van Pijkeren等[24-25]在乳酸菌線性重組方面的研究有了突破性的進(jìn)展，他們在乳酸乳球菌和羅氏乳桿菌中分別構(gòu)建質(zhì)粒pJP005和pJP042誘導(dǎo)表達(dá)recT基因，轉(zhuǎn)化單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞，成功突變基因ddl中的幾個(gè)堿基，使D-丙氨酰-D-丙氨酸連接酶中的一個(gè)氨基酸發(fā)生改變，從而增強(qiáng)菌株對萬古霉素的敏感性。通過MAMA-PCR[26]驗(yàn)證得到突變體，做到了精確定點(diǎn)突變，此方法不需要抗生素及類似篩選標(biāo)記。

相對于經(jīng)典的同源雙交換敲除，單鏈重組有更多的優(yōu)勢。它操作簡單，重組效率高，不受酶切位點(diǎn)限制，所需同源臂較短，50 bp左右即可，可以直接采用PCR 方法擴(kuò)增獲得。但是這種方法中的重組酶recT在不同菌株中的表達(dá)效果不同，不是所有的乳酸菌都適用于這種方法。

3　影響敲除效率的因素

乳酸菌作為革蘭氏陽性菌，含有一層較厚的細(xì)胞壁，對其進(jìn)行遺傳操作比較困難，所以其重組效率一般較低。但是可以通過優(yōu)化相關(guān)因素提高其敲除效率，例如利用溫敏復(fù)制子、引入反向篩選標(biāo)記等。

3.1溫敏敲除系統(tǒng)

相對于利用普通非復(fù)制型載體進(jìn)行基因整合，利用溫敏敲除系統(tǒng)具有更高的效率。在溫敏敲除系統(tǒng)中，敲除載體的復(fù)制子為溫敏型復(fù)制子，轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞后，在低溫下可以讓載體復(fù)制，高于特定溫度時(shí)載體丟失，達(dá)到消除載體的目的。利用溫敏敲除系統(tǒng)，載體在低溫復(fù)制時(shí)，會得到大量拷貝，從而提高二次重組效率。1992年MAGUIN等[27]對廣譜型復(fù)制子pWV01突變得到了一種突變質(zhì)粒pVE6002，并把這個(gè)溫敏復(fù)制子應(yīng)用于敲除載體的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)其具有較高的敲除效率。Biswas等[28]在1993年構(gòu)建了大腸桿菌-乳酸菌穿梭敲除質(zhì)粒pGhost5，它在37 ℃時(shí)不能復(fù)制, 但在28 ℃時(shí)能滾環(huán)復(fù)制。研究表明用這個(gè)載體，發(fā)生雙交換時(shí)的剪切效率提高了100～1000倍。這兩個(gè)載體的發(fā)現(xiàn)，極大促進(jìn)了乳酸菌基因敲除的進(jìn)展，并沿用至今。最近，Steele等[29]利用pGhost5溫敏敲除系統(tǒng)成功敲除掉乳酸乳球菌LM0230的ilvE基因，證明了它在氨基酸代謝中的重要作用。2015年，LANGA等[30]則利用pWV01衍生溫敏質(zhì)粒pVE6007(repA+)和敲除載體pORI28(repA-)，共同敲除短乳桿菌pdh30基因，以研究pdh30在甘油代謝中的作用。通過高效液相色譜分析pdh30突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)基因pdh30參與3-羥基丙酸的生物合成。

溫敏型質(zhì)粒是溫敏敲除系統(tǒng)中很有效的遺傳工具，而且其宿主譜較廣，適用于許多革蘭氏陽性菌。應(yīng)用溫敏敲除系統(tǒng)，先在復(fù)制溫度下培養(yǎng)，促進(jìn)轉(zhuǎn)化子的生長繁殖，提高重組效率，重組完成后，改變溫度使質(zhì)粒丟失，通過抗性篩選，得到突變株。但是這個(gè)系統(tǒng)遺傳學(xué)不穩(wěn)定，而且一般需要高溫條件篩選，限制了大部分乳酸菌的生長。

3.2反向篩選標(biāo)記

運(yùn)用同源雙交換的方法敲除基因，發(fā)生第二次重組的效率較低，后期篩選困難。針對該問題，學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，采用合適的負(fù)篩選標(biāo)記利于篩選到正確的突變菌株。反向篩選標(biāo)記能使陽性克隆對一些特殊培養(yǎng)條件敏感，從而促進(jìn)載體序列丟失和同源重組的發(fā)生，提高了篩選效率。同時(shí)，利用反向篩選標(biāo)記還可避免引入抗性基因，達(dá)到無痕敲除的目的。

2008年SOLEM等[31]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可用于乳酸菌的反向標(biāo)記基因oroP，它編碼一種專屬的乳清酸運(yùn)輸?shù)鞍?transporter)。oroP基因的存在，會使細(xì)胞對5-氟乳清酸敏感，所以它可以作為質(zhì)粒丟失時(shí)的篩選標(biāo)記。Solem構(gòu)建了一個(gè)含有反向篩選標(biāo)記基因oroP的載體pCS1966，對乳酸乳球菌IL-1403進(jìn)行改造，成功把磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(tpiA)前的啟動子換成不同的人工合成啟動子。他們的研究表明載體pCS1966是種高效的遺傳操作工具，而且反向篩選標(biāo)記基因oroP可廣泛應(yīng)用于乳酸菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等多種微生物中。

另一種常運(yùn)用于乳酸菌中的反向篩選標(biāo)記基因是upp基因，它廣泛存在于原核生物和某些低等真核生物細(xì)胞中，表達(dá)產(chǎn)物為尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(UPRT)[32]。UPRT能把5-氟尿嘧啶轉(zhuǎn)化成5-氟單磷酸脫氧尿嘧啶，從而使胸腺嘧啶核苷酸合成酶喪失活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。利用這個(gè)特性，upp基因可用作反向篩選標(biāo)記。早期的研究表明刪除upp基因不會影響乳酸菌的嘧啶代謝和生物學(xué)特性[33]。2014年Song等[34]應(yīng)用以溫敏復(fù)制子pWV01和反向篩選標(biāo)記upp構(gòu)建的敲除載體，成功得到干酪乳桿菌ATCC393和乳酸乳球菌MG1363upp基因突變菌株，并發(fā)現(xiàn)除了有5-氟尿嘧啶抗性，它在各方面與野生菌株無明顯不同。2014年Zhang等[35]人利用溫敏質(zhì)粒pKSV7，先構(gòu)建upp缺失菌株LL3 Δupp，然后用upp做反向篩選標(biāo)記，無痕敲除解淀粉芽孢桿菌的基因amyA基因一個(gè)47 kb大小的基因簇bae和rocR基因，在很大程度上提高了聚谷氨酸的產(chǎn)量。

upp作為負(fù)篩選標(biāo)記應(yīng)用廣泛，但仍有一些缺陷，許多微生物基因組中都含有upp基因，因此在使用前需改造得到upp突變菌株，然而在某些菌中，upp有可能參與重要代謝，在缺失upp后，有可能會影響菌株生長。

3.3電轉(zhuǎn)化方法優(yōu)化

通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化方法，提高轉(zhuǎn)化效率，使得重組載體更容易轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸菌細(xì)胞，隨之可提高重組的效率。因?yàn)槿樗峋歉锾m氏陽性菌，被一層致密的厚細(xì)胞壁包裹著，所以轉(zhuǎn)化乳酸菌細(xì)胞時(shí)一般使用電轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法需要先去細(xì)胞壁，操作繁雜且轉(zhuǎn)化效率低，所以轉(zhuǎn)化乳酸菌更常用省時(shí)簡便的電轉(zhuǎn)化法。影響電轉(zhuǎn)化效率的因素較多，如電擊的電壓、乳酸菌所處的生長周期、電擊緩沖液等。

Gerber等[36]先優(yōu)化了電轉(zhuǎn)乳酸乳球菌IL1403的具體步驟，最后使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到106CFU/μg DNA，然后再構(gòu)建以pCR-Blunt IITopo載體衍生的pSG3和pSG7重組質(zhì)粒，把它們電轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸乳球菌后，重組效率是每微克質(zhì)粒DNA產(chǎn)生大約10個(gè)陽性克隆，成功敲除掉基因copA和copB。2012年Spath等[37]發(fā)現(xiàn)利用非甲基化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化植物乳桿菌時(shí)，轉(zhuǎn)化效率得到極大的提高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的同源重組，效率提高明顯。

由于不同種乳酸菌菌株的差異性，具體的電轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件需要在實(shí)驗(yàn)過程中去摸索，比如兩株不同的乳酸菌最適電壓可能存在很大差異。當(dāng)電轉(zhuǎn)化達(dá)到一個(gè)理想的效果，再進(jìn)行基因敲除，也會使敲除效率得到提高。

3.4其他因素

利用重組載體打靶時(shí)，同源臂的長度是影響重組效率的一項(xiàng)重要因素。LELOUP等[38]發(fā)現(xiàn)在沙克乳桿菌中，同源臂長度1 kb以內(nèi)，重組效率隨同源臂長度增加呈線性增長，大于1 kb后，再增加同源臂長度，重組效率無明顯增高。同樣GERBER等[36]也在乳酸乳球菌IL1403中做了相關(guān)研究，得到相同的結(jié)果。

另外，利用單鏈DNA進(jìn)行重組時(shí)，也存在一些因素影響重組效率，例如單鏈DNA的濃度、單鏈的類型、修飾末端等。vanPijkeren等[39]通過優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在乳酸乳球菌中，使用滯后鏈的重組效率比用前導(dǎo)鏈高25倍，提高寡核苷酸的濃度到500 μg并用硫代磷酸修飾末端后，重組效率提高了10倍。

4　結(jié)論與展望

大部分乳酸菌以益生特性著稱，作為一種重要的工程菌應(yīng)用于醫(yī)藥食品行業(yè)[40]。在分子生物學(xué)中，基因敲除技術(shù)是生物育種的重要技術(shù)支持，也是對乳酸菌進(jìn)行遺傳改造的重要方法。目前常用于乳酸菌的敲除策略是傳統(tǒng)的同源重組雙交換敲除，但它具有重組效率低、耗時(shí)較長、工作繁雜等缺點(diǎn)。隨著現(xiàn)代技術(shù)手段的進(jìn)步，學(xué)者們通過優(yōu)化重組載體和轉(zhuǎn)化效率，在提高敲除效率方面取得了進(jìn)步。另一方面，在乳酸菌中對單鏈重組工程方面的研究也取得了不錯的進(jìn)展，可以更加高效便捷的敲除基因，盡管在適用性方面有一定的限制，但這些研究都為未來乳酸菌基因敲除技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來新興的基因敲除技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。其中，CRISPR/Cas技術(shù)[41]未來極有可能應(yīng)用于乳酸菌中。應(yīng)用該系統(tǒng)WANG 等[42]已經(jīng)成功無痕敲除同樣是革蘭氏陽性菌的貝氏梭狀芽胞桿菌基因spo0A。van Pijkeren等[43]已嘗試把CRISPR/Cas系統(tǒng)和單鏈重組系統(tǒng)結(jié)合起來應(yīng)用于乳酸菌中。MILLEN[44]等的研究從遺傳水平上表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的有效性，及廣闊的應(yīng)用前景。除此之外，RNA干擾(RNAi)[45]、TALENS[46](Transcription Activator-like (TAL) Effector Nucleases)、鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)[47](Zinefinger-nucleases,ZFNs)等高效靶向基因修飾技術(shù)都有待應(yīng)用于乳酸菌中，這將極大的提高基因敲除效率，使乳酸菌的遺傳操作更加便捷。

[1]PETERBAUER C,MAISCHBERGER T,Haltrich D.Food-grade gene expression in lactic acid bacteria[J]. Biotechnology J ournal,2011,6(9):1 147-1 161.

[2]DELAYE L,GONZLEZ-DOMENECH C M,GARCILLN-BARCIA M P,et al.Blueprint for a minimal photoautotrophic cell: conserved and variable genes inSynechococcuselongatusPCC 7942[J]. BMC Genomics,2011,12(1): 25.

[3]HASHIMOTO M,ICHIMURA T,MIZOGUCHI H,et al.Cell size and nucleoid organization of engineeredEscherichiacolicells with a reduced genome[J].Molecular Microbiology,2005,55(1):137-149.

[4]MORIMOTO T,KADOYA R,ENDO K,et al.Enhanced recombinant protein productivity by genome reduction inBacillussubtilis[J].DNA Research,2008,15(2):73-81.

[5]KOMATSU M,UCHIYAMA T,MURA S,et al.Genome-minimizedStreptomyceshost for the heterologous expression of secondary metabolism[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(6):2 646-2 651.

[6]焦晶凱,劉振民,莫蓓紅.乳制品乳酸菌遺傳學(xué)概述[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(1): 160-167.

[7]張霖,趙國屏,丁曉明.位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的機(jī)理和應(yīng)用[J].中國科學(xué):生命科學(xué),2011(12): 1 090-1 111.

[8]LEENHOUTS K J,KOK J,VENEMA G.Campbell-like integration of heterologous plasmid DNA into the chromosome ofLactococcuslactissubsp. lactis[J].Applied and environmental Microbiology, 1989,55(2):394-400.

[9]LEENHOUTS K J,KOK J,VENEMA G. Replacement recombination inLactococcuslactis[J].Journal of Bacteriology, 1991, 173(15):4 794-4 798.

[10]BHOWMIK T,STEELE J L.Development of an electroporation procedure for gene disruption inLactobacillushelveticusCNRZ 32[J].Journal of General Microbiology,1993,139(7):1 433-1 439.

[11]LOKMAN B C,HEERIKHUISEN M,LEER R J,et al.Regulation of expression of theLactobacilluspentosusxylAB operon[J].Journal of Bacteriology,1997,179(17):5 391-5 397.

[12]于慧敏,馬玉超.工業(yè)微生物代謝途徑調(diào)控的基因敲除策略[J].生物工程學(xué)報(bào),2010,26(9): 1 199-1 208.

[13] FERAIN T,HOBBS J N,RICHARDSON J,et al.Knockout of the twoldhgenes has a major impact on peptidoglycan precursor synthesis inLactobacillusplantarum[J].Journal of Bacteriology,1996, 178(18):5 431-5 437.

[14]LIU S.A simple method to generate chromosomal mutations inLactobacillusplantarumstrain TF103 to eliminate undesired fermentation products[J].Applied Biochemistry and Biotechnology, 2006,131(1-3):854-863.

[15]JIN Q,LI L,KIM Y J,et al.Construction of a dextran-freeLeuconostoccitreummutant by targeted disruption of the dextransucrasegene[J].Journal of Applied Microbiology,2014,117(4): 1 104-1 112.

[16]秦艷青,金寧一,李昌,等.乳酸乳球菌同源整合載體的構(gòu)建及鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,34(6):628-633.

[17]李婭妮,趙國芬,包秋華,等.植物乳桿菌lai基因同源重組敲除載體的構(gòu)建與鑒定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊 (下),2014 (3):51-53.

[18]GRINDLEY N D F,WHITESON K L,RICE P A.Mechanisms of site-specific recombination[J].Annu Rev Biochem,2006,75:567-605.

[19]LAMBERT J M,BONGERS R S,KLEEREBEZEM M. Cre-lox-based system for multiple gene deletions and selectable-marker removal inLactobacillusplantarum[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007,73(4):1 126-1 135.

[20]ZHU D,ZHAO K,XU H,et al.Construction ofthyA deficientLactococcuslactisusing the Cre-loxPrecombination system[J].Annals of Microbiology,2015,65(3):1 659-1 665.

[21]BR?NDSTED L,HAMMER K.Use of the integration elements encoded by the temperate lactococcal bacteriophage TP901-1 to obtain chromosomal single-copy transcriptional fusions inLactococcuslactis[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(2):752-758.

[22]PETERSEN K V,MARTINUSSEN J,JENSEN P R,et al.Repetitive, marker-free, site-specific integration as a novel tool for multiple chromosomal integration of DNA[J].Applied and Environmental Microbiology,2013,79(12):3 563-3 569.

[23]王軍平,張友明.Red/ET 重組及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào),2005,21(3): 502-506.

[24]van PIJKEREN J P,BRITTON R A.High efficiency recombineering in lactic acid bacteria[J]. Nucleic Acids Research,2012,40(10):e76-e76.

[25]van PIJKEREN J P,BRITTON R. Precision genome engineering in lactic acid bacteria[J].Microbial Cell Factories,2014,13(Suppl 1):S10.

[26]QIANG Y Z,QIN T,FU W,et al. Use of a rapid mismatch PCR method to detectgyr aandpar cmutations in ciprofloxacin-resistant clinical isolates ofEscherichiacoli[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2002,49(3):549-552.

[27]MAGUIN E,DUWAT P,HEGE T,et al.New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria[J]. Journal of Bacteriology,1992,174(17):5 633-5 638.

[28]BISWAS I,GRUSS A,EHRLICH S D,et al.High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria[J].Journal of Bacteriology, 1993,175(11):3 628-3 635.

[29]ATILES M W,DUDLEY E G,STEELE J L.Gene cloning, sequencing, and inactivation of the branched-chain aminotransferase ofLactococcuslactisLM0230[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(6):2 325-2 329.

[30]LANGA S,ARQUéS J L,GAYA P,et al.Glycerol and cobalamin metabolism in Lactobacilli: relevance of the propanediol dehydrogenasepdh30[J].European Food Research and Technology, 2015，241(2):173-184.

[31]SOLEM C,DEFOOR E,JENSEN P R,et al.Plasmid pCS1966, a new selection/counterselection tool for lactic acid bacterium strain construction based on theoroPgene, encoding an orotate transporter fromLactococcuslactis[J].Applied and Environmental Microbiology,2008,74(15): 4 772-4 775.

[32]MARTINUSSEN J,HAMMER K.Cloning and characterization ofupp, a gene encoding uracil phosphoribosyltransferase fromLactococcuslactis[J].Journal of Bacteriology,1994,176(21): 6 457-6 463.

[33]KRISTICH C J,MANIAS D A,DUNNY G M. Development of a method for markerless genetic exchange inEnterococcusfaecalisandits use in construction ofasrtAmutant[J].Applied and Environmental Microbiology,2005,71(10):5 837-5 849.

[34]SONG L, CUI H, TANG L, et al.Construction of upp deletion mutant strains ofLactobacilluscaseiandLactococcuslactisbased on counterselective system using temperature-sensitive plasmid[J].Journal of Microbiological Methods,2014,102: 37-44.

[35]ZHANG W,GAO W,FENG J,et al.A markerless gene replacement method forB.amyloliquefaciensLL3 and its use in genome reduction and improvement of poly-γ-glutamic acid production[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(21):8 963-8 973.

[36]GERBER S D,SOLIOZ M.Efficient transformation ofLactococcuslactisIL1403 and generation of knock-out mutants by homologous recombination[J].Journal of Basic Microbiology,2007,47(3): 281-286.

[37]SPATH K,HEINL S,GRABHERR R.Direct cloning inLactobacillusplantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete[J].Microb Cell Fact,2012,11:141.

[38]LELOUP L,EHRLICH S D,ZAGOREC M,et al.Single-crossover integration in theLactobacillussakechromosome and insertional inactivation of theptsI andlacLgenes[J].Applied and Environmental Microbiology,1997, 63(6):2 117-2 123.

[39]van PIJKEREN J P,NEOH K M,SIRIAS D,et al.Exploring optimization parameters to increase ssDNA recombineering inLactococcuslactisandLactobacillusreuteri[J].Bioengineered,2012,3(4): 209-217.

[40]郭志華,楊洪.分離自藏靈菇的乳酸菌的益生特性[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(1):151-154.

[41]BARRANGOU R,FREMAUX C,DEVEAU H,et al.CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J].Science,2007,315(5 819):1 709-1 712.

[42]WANG Y,ZHANG Z T,SEO S O,et al.Markerless chromosomal gene deletion inClostridiumbeijerinckiiusing CRISPR/Cas9 system[J].Journal of Biotechnology,2015,200:1-5.

[43]OH J H,van PIJKEREN J P.CRISPR-Cas9-assisted recombineering inLactobacillusreuteri[J]. Nucleic Acids Research,2014:doi:10.1093/nar/gku623.

[44]MILLEN A M,HORVATH P,BOYAVAL P,et al.Mobile CRISPR/Cas-mediated bacteriophage resistance inLactococcuslactis[J].PLoS One,2012,7(12):e51663.

[45]JACKSON A L,BARTZ S R,SCHELTER J,et al.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi[J].Nature Biotechnology,2003,21(6):635-637.

[46]CERMAK T,DOYLE E L,CHRISTIAN M,et al.Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting[J].Nucleic Acids Research,2011:doi:10.1093/nar/gkr 218.

[47]MILLER J C,HOLMES M C,WANG J,et al.An improved zinc-finger nuclease architecture for highly specific genome editing[J].Nature Biotechnology,2007,25(7):778-785.

Advances on gene knockout technology of lactic acid bacteria

DU Sheng-yang，WANG Bin-bin，F(xiàn)ENG Jia，HOU Bin-xiao，QIAO Jian-jun*

(Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072,China)

Lactic acid bacteria(LAB)are Gram-positive bacteria that have been widely used in food, medicine, light industry, feed industry and many other industries. The genetic manipulation of LAB is the foundation of gene regulation and metabolism. We can identify the function of the unknown genes in the genome and assure the application of its encoding product through the gene knockout technology. Besides, the heterologous gene products of LAB can be obtained more purposefully and selectively. Currently, gene knockout has become a newly-developed molecular biological technology in LAB. This article mainly summarized the advances of gene knockout technology of LAB and its efficiencies. The existing problems were analyzed and the development trend of gene knockout of LAB was preliminary discussed.

gene knockout; lactic acid bacteria; homologous recombination; single-strand DNA recombineering; knockout efficiency

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601044

碩士研究生(喬建軍為通訊作者，E-mail：jianjunq@tju.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270142)；國家科技支撐計(jì)劃(2014BAD02B00)

2015-05-18，改回日期：2015-06-20