孟武，王瑞明，肖冬光

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(齊魯工業(yè)大學(xué) 輕工學(xué)部，山東 濟南，250353)

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2,3-丁二醇調(diào)控四甲基吡嗪及乙偶姻合成菌產(chǎn)物產(chǎn)量的研究

孟武1,2，王瑞明2，肖冬光1*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(齊魯工業(yè)大學(xué) 輕工學(xué)部，山東 濟南，250353)

發(fā)酵初期在枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2,3-丁二醇(2,3-BD)可以調(diào)控發(fā)酵產(chǎn)物乙偶姻，四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)的產(chǎn)量。隨著2,3-BD添加量的增加，所產(chǎn)乙偶姻和TTMP的量隨之增加，當(dāng)2,3-BD的添加量≥4.0 g/L時，乙偶姻和TTMP的產(chǎn)量不再增加。同時，枯草芽孢桿菌的生物量、糖轉(zhuǎn)化率也隨之變化。該調(diào)控方法對枯草芽孢桿菌的分子改造菌株(ΔbdhA)調(diào)控產(chǎn)乙偶姻和TTMP的產(chǎn)量影響不大。

四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,TTMP)；乙偶姻；產(chǎn)量；枯草芽孢桿菌；調(diào)控

吡嗪類化合物是一類含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的化合物總稱，具有似牛肉加熱時的香味、果仁及可可香味，稀釋至300 mg/kg時呈巧克力香味，在茅臺酒及芝麻香型白酒中大量存在，是白酒香氣的主要組分[1]。此外，四甲基吡嗪(TTMP)是一種對人體有益的物質(zhì)，可以降血壓，并在醫(yī)藥合成中被廣泛應(yīng)用[2-3]。乙偶姻通常情況下可添加于食品中，增加食品的香氣，是一種天然的食品添加劑[4]，在醫(yī)藥行業(yè)，乙偶姻由于具有不同的構(gòu)型可以用來合成稀有藥物及作為藥物中間體，另外，它在煙草[5]、塑料、化學(xué)及涂料工業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用[6]。

目前，在白酒行業(yè)中尚未對吡嗪類化合物的研究引起足夠重視，并且吡嗪類化合物的代謝途徑及調(diào)控機理尚不明確。白酒業(yè)的科研人員最初認(rèn)為，吡嗪是由美拉德反應(yīng)生成的[7]，后來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)加熱分解途徑、氨基酸類加熱分解途徑、微生物代謝產(chǎn)物途徑也能產(chǎn)生吡嗪類化合物。江南大學(xué)首次證實了中國白酒中TTMP并非美拉德途徑所產(chǎn)生，確定了白酒中TTMP的產(chǎn)生機制[8]，并在“中國白酒169 計劃”中對相關(guān)研究結(jié)果進行了闡述，包括產(chǎn)生TTMP的微生物(枯草芽孢桿菌)、產(chǎn)生途徑及代謝調(diào)控，其TTMP的生產(chǎn)能力達(dá)到了國際領(lǐng)先水平，并將相關(guān)技術(shù)應(yīng)用到了釀酒企業(yè)，明顯提高了TTMP的含量。

釀酒中產(chǎn)生吡嗪類化合物多以細(xì)菌發(fā)酵為主，尤其以芽孢桿菌類菌株中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主[9-10]。由于釀酒中產(chǎn)生吡嗪類化合物的合成機理尚不清確，吡嗪的種類及其對酒的風(fēng)味及功能貢獻(xiàn)尚不明確，目前關(guān)于微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙偶姻的研究報道較少，且產(chǎn)量較低。劉建軍等獲得1株產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌，以葡萄糖為碳源，得到16.3 g/L的乙偶姻[11]。因此，研究TTMP和乙偶姻的代謝途徑與調(diào)控機制來提高其產(chǎn)量具有較大的實用價值。

以目前的研究水平，很難通過底物添加來調(diào)控提高TTMP和乙偶姻的產(chǎn)量。已有報道，通過補料和內(nèi)源策略[12-13]、篩選基因突變株[14]等方法的研究，觀察其對TTMP和乙偶姻發(fā)酵產(chǎn)量以及減少副產(chǎn)物濃度的影響。本實驗中，通過在發(fā)酵前期添加2,3-丁二醇(2,3-BD)進行發(fā)酵調(diào)控實驗，研究對枯草芽孢桿菌TTMP和乙偶姻發(fā)酵產(chǎn)量的影響，從而以最低成本來提高所產(chǎn)TTMP和乙偶姻的量。主要考察了發(fā)酵初期添加2,3-BD對枯草芽孢桿菌的TTMP和乙偶姻發(fā)酵產(chǎn)量的影響，同時，結(jié)合2,3-BD調(diào)控對該菌株的基因改造菌株(ΔbdhA)的目的產(chǎn)物影響實驗，研究分析2,3-BD調(diào)控提高目的產(chǎn)物的效果及基本機理。

1　材料與方法

1.1菌種

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisBS2)，由齊魯工業(yè)大學(xué)輕工學(xué)部王瑞明教授提供。

TTMP高產(chǎn)基因工程菌枯草芽孢桿菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)，由天津科技大學(xué)對B.subtilisBS2分子改造獲得。

1.2培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)方法

培養(yǎng)基：Luria-Bertani (LB培養(yǎng)基)；YPG培養(yǎng)基(參照文獻(xiàn)[15])。

種子培養(yǎng)方法：在無菌條件下，用接種環(huán)取一環(huán)活化好的斜面菌種接種到裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h。然后按接種量2%(體積分?jǐn)?shù))接到裝有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌體生長量OD600值為0.05，作為種子。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：將種子液按4%體積分?jǐn)?shù)的接種量接種到裝有200 mL含70 g/L葡萄糖的YPG培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 d，期間每12 h補加5 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液。

添加2,3-BD調(diào)控實驗，在發(fā)酵初期向培養(yǎng)基加入分別為：1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 g/L梯度質(zhì)量濃度的2,3-BD，定時取樣分析產(chǎn)物產(chǎn)量、生物量變化情況。

1.3分析方法

HPLC色譜柱，Bio-Rad HPX 87H用于對產(chǎn)物進行分離，測定殘余葡萄糖的濃度。頂空固相微萃取(HS-SPME)和氮磷檢測器(GC-6890 NPD)，分離并測定乙偶姻和TTMP的濃度。色譜柱為HP-INNOWax: 30 m×250 μm×0.25 μm，氣相色譜分析測定

2,3-BD的濃度。細(xì)胞生長量的測定：用紫外分光光度計對細(xì)胞生長的OD600值進行監(jiān)測。

2　結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻的影響

2.1.1pH對枯草芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻的影響

B.subtilisBS2的細(xì)胞生長量、TTMP和乙偶姻的發(fā)酵產(chǎn)量受pH的影響。在pH分別為6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的條件下進行發(fā)酵。當(dāng)pH控制在7.5時，B.subtilisBS2的OD600值最高，為12.16，結(jié)果如圖1；乙偶姻的合成在144 h達(dá)最高產(chǎn)量11.28 g/L，而后下降。當(dāng)pH低于或高于7.5時，B.subtilisBS2的OD600值都低于10.38，乙偶姻的產(chǎn)量也在pH為7.5時達(dá)到最高值，結(jié)果如表1。

圖1　不同pH發(fā)酵條件對B.subtilis BS2菌體細(xì)胞生長的影響Fig.1　Effect of different pH control on the cell growth of B.subtilis BS2(數(shù)據(jù)是3組實驗平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差)

pH值時間a/h乙偶姻產(chǎn)量/(g·L-1)時間b/hTTMP產(chǎn)量/(g·L-1)OD600max6.5144.27.13±0.03168.215.15±0.089.52±0.017.0144.79.38±0.04168.718.56±0.1210.27±0.047.5144.311.28±0.04168.321.84±0.4012.16±0.078.0144.410.25±0.03168.419.27±0.1110.38±0.068.5155.99.16±0.05168.917.87±0.099.73±0.05

注：a從接種到乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間；b從接種到TTMP產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間。數(shù)據(jù)是3組實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.1.2添加2,3-BD對枯草芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻的影響

在發(fā)酵初期向培養(yǎng)基加入梯度質(zhì)量濃度的2,3-BD：1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 g/L，HPX 87H色譜柱檢測分析產(chǎn)物和碳源底物消耗變化量，HS-SPME聯(lián)合GC-6890 NPD分別檢測產(chǎn)物乙偶姻和TTMP含量變化量，如表2。隨著2,3-BD添加量由1.0 g/L增加到3.0 g/L，B.subtilisBS2產(chǎn)乙偶姻的最高產(chǎn)量由11.28 g/L提高到15.4 g/L。乙偶姻的合成受添加2,3-BD的影響，當(dāng)培養(yǎng)基中2,3-BD的添加量提高到3.0 g/L以上時，發(fā)酵產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量不再增加并且隨著2,3-BD添加量的增加有所減少。同時，隨著添加2,3-BD量的增加，細(xì)胞生長略受影響。2,3-BD的添加，可以提高乙偶姻的產(chǎn)量和菌體細(xì)胞生長量，在添加量為3.0 g/L時OD600達(dá)到最大值為17.72，葡萄糖利用率隨著2,3-BD的添加也略有提高，見表2，圖2。綜合考慮發(fā)酵時間以及2,3-BD添加量、產(chǎn)物量，可見，2,3-BD調(diào)控B.subtilisBS2發(fā)酵產(chǎn)物，最佳添加量為3.0 g/L，可以得到15.4 g/L的乙偶姻最大產(chǎn)量。添加2,3-BD調(diào)控乙偶姻的產(chǎn)量，針對草芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)是有效可行的。

圖2　添加2,3-BD調(diào)控(實心)對B.subtilis 的影響Fig.2　Effect of addition of 2,3-BD on the cell growth, 2,3-BD production and glucose specific uptake rate(residual glucose)by B.subtilis BS2. Product proles of BS2 (Open) and BS2 with addition of 3 g/L 2,3-BD (lled symbols) are shown (數(shù)據(jù)是三組實驗平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差)

2.2添加2,3-丁二醇對枯草芽孢桿菌產(chǎn)TTMP的影響

TTMP發(fā)酵產(chǎn)量同樣受pH的影響。當(dāng)pH控制在7.5時，TTMP的合成在168 h左右達(dá)最高產(chǎn)量21.84 g/L，當(dāng)pH低于或高于7.5時，TTMP的產(chǎn)量都低于此值，結(jié)果如表1。分析產(chǎn)物表明，添加2,3-BD對提高B.subtilisBS2產(chǎn)TTMP有較明顯的效果，并且2,3-BD添加量對TTMP和乙偶姻的產(chǎn)量影響有一致性，如表2。隨著2,3-BD添加量由1.0 g/L增加到3.0 g/L，B.subtilisBS2產(chǎn)TTMP的最高產(chǎn)量由21.84 g/L提高到29.65 g/L，當(dāng)2,3-BD的添加量大于3 g/L時，發(fā)酵產(chǎn)物TTMP的產(chǎn)量不再增加并且隨著2,3-BD添加量的增加有所減少?？傮w上，添加2,3-BD調(diào)控TTMP和乙偶姻的產(chǎn)量影響有一致性，針對草芽孢桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)是有效可行的。

表2　2,3-BD調(diào)控對B.subtilis BS2產(chǎn)物乙偶姻和TTMP的影響

注：a從接種到乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間；b從接種到TTMP產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間。數(shù)據(jù)是3組實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.3測定結(jié)果與分析

基因工程菌株枯草芽孢桿菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)，此菌體以葡萄糖為碳源合成乙偶姻和TTMP的主要發(fā)酵產(chǎn)物，與以上2,3-BD調(diào)控同理，以2,3-BD調(diào)控提高TTMP和乙偶姻的發(fā)酵產(chǎn)量。檢測B.subtilisBSA (ΔbdhA)的發(fā)酵產(chǎn)物乙偶姻，TTMP產(chǎn)量、菌體生長量，結(jié)果如表3。添加2,3-BD對提高該菌的乙偶姻和TTMP的產(chǎn)量沒有明顯效果，隨著2,3-BD添加量的增加，乙偶姻和TTMP的產(chǎn)量值有所浮動，但變化較小，同時對菌體細(xì)胞生長量略有提高的作用。

表3　2,3-BD調(diào)控對B.subtilis BSA (ΔbdhA)產(chǎn)物乙偶姻和TTMP的影響

注：a從接種到乙偶姻產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間；b從接種到TTMP產(chǎn)量達(dá)到最高時的發(fā)酵時間。數(shù)據(jù)是3組實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3　討論

對比不同培養(yǎng)基的pH值對B.subtilisBS2產(chǎn)乙偶姻及TTMP量的影響，B.subtilisBS2的最適pH值是7.5左右。因為培養(yǎng)基的pH值主要影響菌體細(xì)胞膜表面帶電基團的解離及其微觀結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞膜兩側(cè)質(zhì)子動力的變化，進而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝物的分泌，從而導(dǎo)致乙偶姻及TTMP的產(chǎn)量都相對較高，菌體的細(xì)胞生長量也較高。

發(fā)酵初期添加2,3-BD調(diào)控B.subtilisBS2產(chǎn)乙偶姻及TTMP量實驗得出，該調(diào)控方法對該菌效果明顯。2,3-BD調(diào)控能提高B.subtilisBS2的乙偶姻和TTMP產(chǎn)量，以及菌體細(xì)胞生長量，其最佳添加量為3.0 g/L，但是對調(diào)控B.subtilisBSA (ΔbdhA)的乙偶姻及TTMP產(chǎn)量沒有明顯效果。發(fā)酵初期添加2,3-BD有利于這兩種菌的菌體生長，當(dāng)添加量大于3.0 g/L時，乙偶姻及TTMP產(chǎn)量都有所降低。但總體評價，2,3-BD調(diào)控方法提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)乙偶姻及TTMP量是具有成本效益的。

實驗結(jié)果表明，發(fā)酵初期添加少量2,3-BD可以提高TTMP和乙偶姻的發(fā)酵產(chǎn)量，但具體機理尚不明晰。推測由于乙偶姻和2,3-BD的轉(zhuǎn)化之間是可逆的，兩者通過2,3-丁二醇脫氫酶又名3-羥基丁酮還原酶(由bdhA基因轉(zhuǎn)錄生成)催化合成，乙偶姻又作為前體合成TTMP，如圖3所示。

圖3　葡萄糖在枯草芽孢桿菌中生成乙偶姻和TTMP的代謝途徑Fig.3　The acetoin and TTMP biosynthetic pathways from glucose in B. subtilis BSA (ΔbdhA)

發(fā)酵初期加入2,3-BD，首先能夠起到反饋抑制的作用，同時2,3-丁二醇脫氫酶是可逆的，能夠促進乙偶姻的生成和積累，進而提高TTMP的產(chǎn)量。另外，有文獻(xiàn)報道，在培養(yǎng)基中缺乏碳源的條件下，2,3-BD能夠繼續(xù)充當(dāng)碳源生成乙偶姻[16]，利于乙偶姻的合成和積累，從而促進TTMP的合成。從誘導(dǎo)調(diào)控效果看，此方法對提高基因工程菌株枯草芽孢桿菌B.subtilisBSA (ΔbdhA)的乙偶姻及TTMP產(chǎn)量沒有明顯效果，分析可能是由于該菌為敲除基因bdhA的分子改造菌，如圖3所示，從而消除了乙偶姻跟2,3-BD的可逆合成，不能促進乙偶姻的生成和積累，進而也不能提高TTMP的產(chǎn)量，為2,3-BD調(diào)控的機理研究提供了一定依據(jù)。發(fā)酵初期添加2,3-BD調(diào)控提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)乙偶姻和TTMP產(chǎn)量的具體機理還需要酶的結(jié)構(gòu)功能以及代謝途徑做進一步研究。

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Effects of cultivation conditions on the yields of acetoin and TTMP

MENG Wu1，2, WANG Rui-ming2, XIAO Dong-guang1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology, TEDA, Tianjin 300457, China)2(Key Laboratory of Shandong Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353, China)

The effect of cultivation conditions on the yields of TTMP and acetoin compounds produced byBacillussubtiliswere investigated. The yields of TTMP and acetoin were influenced by the supplementation of 2,3-BD to fermentation medium. The yields of TTMP and acetoin were increased with the increasing addition of 2,3-BD until the concentration of supplemented 2,3-BD in matrix reached 4.0 g/L. Meanwhile, the biomass and glucose conversion rate were also changed with the addition of 2,3-BD. Using this method, the supplementation of 2,3-BD showed a little influence on TTMP and acetoin production by abdhAknockout strain ofB.subtilis.

tetramethylpyrazine(TTMP); acetoin; yield;B.subtilis;B.subtilis(ΔbdhA); regulation

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601004

碩士研究生(肖冬光教授為通訊作者，E-mail:xiaoqq@tuet.edu.cn)。

本項目受國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA022108)；山東省科技發(fā)展計劃(2014GSF121008)

2015-07-24，改回日期：2015-09-14