蔣卓越，季偉，錢蓓蓓，朱益波*，齊斌

1(蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州,215123)2(常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,江蘇 常熟,215500)

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乳酸脫氫酶突變體D-LDHY52L在大腸桿菌中的重組表達(dá)及其合成D-苯基乳酸的研究

蔣卓越1，季偉2，錢蓓蓓2，朱益波2*，齊斌2

1(蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州,215123)2(常熟理工學(xué)院 蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,江蘇 常熟,215500)

LactobacilluspentosusD-乳酸脫氫酶的三維構(gòu)象表明氨基酸序列中第52位的酪氨酸非常接近底物酮酸鹽C3位上的基團(tuán)。該研究利用定點(diǎn)突變技術(shù)將第52位的親水性的酪氨酸替換成疏水性的亮氨酸，有效提高了D-乳酸脫氫酶對底物苯丙酮酸的催化活力。在大腸桿菌中重組表達(dá)后，利用重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸合成D-苯基乳酸。結(jié)果表明，D-苯基乳酸的產(chǎn)量比未突變菌株提高了46%，產(chǎn)量達(dá)18.47 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)65.96%。

D-乳酸脫氫酶; 定點(diǎn)突變;重組表達(dá);苯丙酮酸;D-苯基乳酸

D-苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)即2-羥基-3-苯基丙酸，作為一種新型的廣譜抗菌物質(zhì),具有分子量小，穩(wěn)定性高,溶解性好等優(yōu)點(diǎn)[1-2]。D-苯基乳酸在較低濃度時(shí)就能有效地抑制大部分食品腐敗菌,其抑菌活性強(qiáng)于一些常用的食品防腐劑,如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等[3-5]。D-苯基乳酸作為乳酸菌的代謝產(chǎn)物，即苯丙氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成苯丙酮酸，進(jìn)而脫氫合成苯乳酸,是天然的抗菌物質(zhì)，在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景[6-8]。

目前，D-苯基乳酸的合成方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法，但由于化學(xué)合成法存在污染環(huán)境，技術(shù)復(fù)雜，產(chǎn)物不純等缺點(diǎn)，生物合成法受到更多研究者的青睞[9]。2000年，Lavermicocca等通過對乳酸桿菌的研究，首次報(bào)道了乳酸菌Lactobacillusplantarum21B的發(fā)酵培養(yǎng)液中含有苯基乳酸[10]。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)數(shù)量眾多的乳酸菌具備合成PLA的能力。近幾年陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道其他的微生物如Bacilluscoagulans[11]、Geotrichumcandidum[12]和Rubrivivaxbenzoatilyticus[13]也能夠合成PLA，其中ZHAO[11]報(bào)道的1株嗜熱芽孢桿菌B.coagulansSDM，產(chǎn)苯基乳酸量達(dá)到37.2 g/L。這是目前報(bào)道的苯基乳酸產(chǎn)量最高的菌株。 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程定向改造微生物得到越來越多研究人員的關(guān)注。趙明月等[14]將D-乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶克隆到大腸桿菌中過表達(dá)，經(jīng)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，苯基乳酸產(chǎn)量累積達(dá)18.92 g/L。這是目前大腸桿菌作為宿主轉(zhuǎn)化生成苯基乳酸產(chǎn)量最高的菌株。

ISHIKURA等[15]和TOKUDA等[16]研究表明，LctobacillauspentosusD-乳酸脫氫酶的三維構(gòu)象表明氨基酸序列中第52位的親水的酪氨酸非常接近底物酮酸鹽的C3位上的取代基，和底物的識(shí)別有緊密相關(guān),將52位的酪氨酸替換成疏水的氨基酸能顯著提高底物對苯丙酮酸的親和力和催化活力。本研究利用基因工程技術(shù)，將來自L.plantarum的D-ldh通過定點(diǎn)突變，將氨基酸序列中52位的親水的酪氨酸突變成疏水的亮氨酸，隨后將突變基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)過表達(dá)，以苯丙酮酸為底物，全細(xì)胞合成D-苯基乳酸。通過對轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，D-苯基乳酸的產(chǎn)量比未突變菌株有顯著提高。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

D-苯基乳酸和苯丙酮酸標(biāo)品，國藥集團(tuán)；酵母提取物、胰蛋白胨，Oxoid公司(英國)；DNA 聚合酶,硫酸卡那和相關(guān)分子試劑盒，上海生工；定點(diǎn)突變試劑盒、限制性內(nèi)切酶，大連寶生物公司(TaKaRa)，所有實(shí)驗(yàn)試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.1.2菌種和質(zhì)粒

Lactobacillusplantarum(CGMCC:1.2437)，中國菌種保藏中心(CGMCC)；pMD19-T Simple Vector，寶生物公司(大連)；E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliBL21(DE3),pET-28a(+)均為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3主要儀器

PCR擴(kuò)增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-RAD公司；高速臺(tái)式離心機(jī)，德國Thermo公司；恒溫金屬浴，德國Eppendorf公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.2方法

1.2.1基因片段的克隆，定點(diǎn)突變和質(zhì)粒的構(gòu)建

乳酸脫氫酶基因來自于植物乳桿菌CGMCC(1.2437)，以其基因組為模板，PCR擴(kuò)增獲得乳酸脫氫酶基因,擴(kuò)增所用引物序列如下：

上游引物(含BamHI酶切位點(diǎn))：

P1:CGCGGATCCATGAAAATTATTGCATATGC

下游引物(含HindIII酶切位點(diǎn))：

P2:CCCAAGCTTTTAATCAAACTTAACTTGTG

純化后的克隆產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連入pMDTM19-T，然后將構(gòu)建pMD-ldh質(zhì)粒導(dǎo)入DH5α體內(nèi)。質(zhì)粒pMD-ldh在菌體內(nèi)大量克隆后經(jīng)快切酶BamHI-HindIII酶切后與經(jīng)過同樣酶切的質(zhì)粒載體pET-28a連接，重組質(zhì)粒pET-28a-ldh構(gòu)建成功。

目的基因的定點(diǎn)突變根據(jù)TaKaRa MutanBEST Kit試劑盒指示操作，以重組質(zhì)粒pET-28a-ldh為模板，P3，P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將氨基酸序列中的酪氨酸替換為亮氨酸，獲得帶有突變位點(diǎn)的重組質(zhì)粒pET-28a-D-ldhY52L。

引物序列如下：

P3 :5-CCTTTTGTTGAGCTACATCGGCACCGT￣C￣G￣A￣A￣G￣C

P4 :5-TGCCGATGTAGCTCAACAAAAGGACTA￣T￣A￣C￣T￣G￣C

將重組質(zhì)粒pET-28a-D-ldhY52L轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌 BL21 (DE3) 體內(nèi)，命名為BL21 (DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L。轉(zhuǎn)化子分別經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證、質(zhì)粒酶切驗(yàn)證(如圖1所示)和測序驗(yàn)證確保獲得正確質(zhì)粒。

1.2.2乳酸脫氫酶活力的測定

將活化的重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-D-ldh，E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L和空載體對照E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+) 按 1%的接種量接種到裝有100 mL LB 液體培養(yǎng)基 (含50 mg/L卡那霉素) 的搖瓶中，37 ℃、200 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)至 OD600值為0.6～0.8后，添加IPTG至0.6 mmol/L，25 ℃誘導(dǎo)4 h后，取一定量的菌體離心洗滌后，稀釋至OD600=1，取1 mL的菌體離心后加入500 μL的B-PER試劑，充分混勻后30 ℃裂解10 min，之后12 000 r/min離心10 min，取適量上清液進(jìn)行乳酸脫氫酶酶活測定?；驹硎荖ADH在340 nm處有最大吸收峰，通過光吸峰值的改變定量測定酶的含量。乳酸脫氫酶檢測的標(biāo)準(zhǔn)液為：0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH為7.0),10 mmol/L丙酮酸或苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L的NADH。反應(yīng)在30 ℃連續(xù)測定反應(yīng)液3 min在340 nm吸收值的變化。酶活定義為：在30 ℃,pH 7.0的條件下，每分鐘消耗1 μmol NADH所需的酶量為1個(gè)酶活單位(1 μmol/min=1 U)。比活力定義為：每毫克粗酶蛋白中酶單位的數(shù)量(U/mg)。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檢測參照Bradford的標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.2.3重組菌的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成D-苯基乳酸條件的優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)在搖瓶中考察不同的轉(zhuǎn)化溫度(20，25，30，35 ℃)，誘導(dǎo)劑濃度(0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mmol/L)，誘導(dǎo)時(shí)間(4，6，8，10 h)和pH(6.5，7，7.5，8)對突變菌株全細(xì)胞合成D-苯基乳酸的影響。重組大腸桿菌基礎(chǔ)誘導(dǎo)條件:OD600值為0.6時(shí)添加IPTG至0.6 mmol/L, 25 ℃誘導(dǎo)4 h。將菌體于4 ℃，6 000 r/min離心10 min, 收集菌體用 pH7.0 PBS洗滌2次,重懸于10 mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中(pH 7.0的100 mmol/L的磷酸鉀溶液溶有7.5 g/L苯丙酮酸),37 ℃，200 r/min轉(zhuǎn)化30 min后取樣用高效液相色譜檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

1.2.4搖瓶中流加轉(zhuǎn)化

在最優(yōu)的誘導(dǎo)條件和轉(zhuǎn)化條件下,將菌體懸浮于50 mL轉(zhuǎn)化液,菌體干重20 g，苯丙酮酸和葡萄糖起始濃度分別為 6 g/L，20 g/L。分別在0.5，1，1.5，2.5 h添加0.2 g的苯丙酮酸鈉,在4，5，6 h添加0.1 g苯丙酮酸鈉，定時(shí)取樣。

1.2.5高效液相色譜檢測

苯丙酮酸鈉，D-苯基乳酸和葡萄糖的檢測:取一定量轉(zhuǎn)化液于 4 ℃，12 000 r/min 離心 20 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后高效液相(島津，LC-20A)檢測。色譜條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H 有機(jī)酸分析柱；流動(dòng)相為 5 mmol/L稀硫酸；流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃； 進(jìn)樣體積5 μL，檢測波長210 nm。其中苯丙酮酸鈉和D-苯基乳酸用紫外檢測器檢測，葡萄糖用RID-10A示差檢測器檢測。

2　結(jié)果與討論

2.1目的基因的表達(dá)與功能驗(yàn)證

用于本研究的Lactobacillusplantarum(CGMCC:1.2437)乳酸脫氫酶基因(D-ldh)編碼 332 個(gè)氨基酸，第52位酪氨酸經(jīng)過定點(diǎn)突變成亮氨酸。大腸桿菌原始菌和空載體對照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)、重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-D-ldh、突變重組菌E.coliBL21(DE3)/ pET-28a-D-ldhY52L經(jīng)1 mmol/L IPTG，25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h收集菌體，用于全細(xì)胞轉(zhuǎn)化。取一部分菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。該重組菌在近41 ku處有明顯蛋白條帶(圖2,泳道3)，相對分子質(zhì)量和預(yù)期的大小一致,表明乳酸脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)成功。酶活測定結(jié)果表明(表1)野生型重組乳酸脫氫酶的比酶活力為6.7U/mg，將乳酸脫氫酶52位的酪氨酸突變成亮氨酸后，乳酸脫氫酶對苯丙酮酸催化活力有顯著提高，較野生型乳酸脫氫酶提高了9.4倍，比酶活力達(dá)到63.1 U/mg。突變株對丙酮酸的催化活力大幅下降。這些結(jié)果與日本學(xué)者 ISHIKURA 等[15]和TOKUDA等[16]的研究結(jié)果一致?？瞻状竽c桿菌和空載體對照E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)檢測不到乳酸脫氫酶活力，與袁劍等[17]的研究結(jié)果一致。

突變重組大腸桿菌和對照菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖3。定點(diǎn)突變重組菌的產(chǎn)量達(dá)到5.34 g/L，比未突變重組菌D-苯基乳酸的產(chǎn)量(3.66 g/L)增加了46%。說明將乳酸脫氫酶底物結(jié)合位點(diǎn)處的親水性的酪氨酸替換成疏水性的亮氨酸，明顯增強(qiáng)了乳酸脫氫酶對底物苯丙酮酸的催化活力，使其具有了更強(qiáng)的催化效率。但突變菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化底物能力的提升

有限，與突變型乳酸脫氫酶粗酶對苯丙酮酸的酶活測定結(jié)果有差異。這是因?yàn)轶w外酶活力測定體系含有足夠多的輔因子提供還原力，氧化還原反應(yīng)能持續(xù)進(jìn)行。突變菌株全細(xì)胞轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯基乳酸的反應(yīng)會(huì)因?yàn)榘麅?nèi)輔因子的不足而中斷[18]。另一方面，胞內(nèi)轉(zhuǎn)化反應(yīng)還與胞內(nèi)底物和產(chǎn)物的量有關(guān)，胞內(nèi)轉(zhuǎn)化反應(yīng)速率會(huì)受到底物運(yùn)輸?shù)男视绊憽?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物苯基乳酸具有廣譜抑菌作用，產(chǎn)物累積超過菌體耐受濃度時(shí)會(huì)破壞菌體的新陳代謝，抑制酶的活性[4]。

大腸桿菌原始菌BL21(DE3)和含有pET-28a空質(zhì)粒的大腸桿菌亦有一定的能力催化生成D-苯基乳酸，產(chǎn)量分別為0.98 g/L和0.77 g/L，可能大腸桿菌胞內(nèi)也有少量能轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸的氧化還原酶。

圖1　質(zhì)粒pET-28a-D-ldh 雙酶切驗(yàn)證圖Fig.1　The verification of the plasmid pET-28a-D-ldhY52L

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker;1-原始菌株；2-空質(zhì)粒菌株；3-經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌圖2　重組質(zhì)粒pET-28a-D-ldhY52L在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.2　The analysis of D-lactate dehaydrogenase protein by SDS-PAGE

底物比酶活/(U·mg-1)E.coliBL21(DE3)E.colipET-28aE.colipET-28a-ldhE.colipET-28a-ldhY52L丙酮酸(pyruvate)NDND17.2±0.398.3±0.12苯丙酮酸(phenylpyruvicacid,PPA)NDND6.7±0.1963.1±1.32

ND: not detected.

圖3　不同菌株產(chǎn)D-苯基乳酸產(chǎn)量的比較Fig.3　The bioconversion effect of native strains and recombinant strains

2.2突變菌株轉(zhuǎn)化生成D-苯基乳酸條件的優(yōu)化

2.2.1誘導(dǎo)溫度對突變重組菌轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的影響

由圖4A可看出，誘導(dǎo)溫度對D-苯基乳酸的產(chǎn)量有著較大的影響，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，D-苯基乳酸的產(chǎn)量比誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)和35 ℃的產(chǎn)量分別高出3.5%和58.63%。由此可見，25 ℃為D-苯基乳酸生產(chǎn)的最適溫度，過低或者過高的溫度都不利于D-苯基乳酸的轉(zhuǎn)化生成。

2.2.2誘導(dǎo)劑濃度對突變重組菌轉(zhuǎn)化合成D-苯基乳酸的影響

當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.2 mmol/L時(shí)，D-苯基乳酸的

產(chǎn)量達(dá)到6.04g/L(圖4B)，比原始誘導(dǎo)條件0.6 mmol/L高出13%。而當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度逐漸加大時(shí)，D-苯基乳酸的產(chǎn)量呈下降趨勢。我們同時(shí)測定了不同濃度誘導(dǎo)劑下的菌體密度，濃度過高的誘導(dǎo)劑對菌體生長起抑制作用。

2.2.3誘導(dǎo)時(shí)間對突變重組菌合成D-苯基乳酸的影響

誘導(dǎo)時(shí)間對D-苯基乳酸合成的影響如圖4C所示，不超過6 h的情況下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，D-苯基乳酸的產(chǎn)量顯著提高，在6 h時(shí)候達(dá)到最大值，原因是大腸桿菌的菌體濃度隨時(shí)間增加呈逐漸上升趨勢。然而誘導(dǎo)時(shí)間增加到 8 h的時(shí)候，D-苯基乳酸的產(chǎn)量急劇下降，可能是全細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性降低。轉(zhuǎn)化時(shí)間為10 h的時(shí)候，D-苯基乳酸的產(chǎn)量有了稍微的上升，應(yīng)該與菌體量達(dá)到新積累有關(guān)。

2.2.4pH對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響

由于大腸桿菌的最適生長pH在6.0～8.0，所以本研究選取pH值6.0～8.0作為研究范圍(圖4D)，如圖所示，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的pH對D-苯基乳酸的轉(zhuǎn)化生成反應(yīng)影響不是很顯著，但pH為8.0時(shí)，D-苯基乳酸的產(chǎn)量明顯降低。pH值為6.5～7.5時(shí)有利于大腸桿菌的生長和D-苯基乳酸的積累。

圖4　不同誘導(dǎo)條件對D-苯基乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of different induction condition on the production of D-PLA

2.3底物流加強(qiáng)化D-苯基乳酸合成

由于底物的積累對D-苯基乳酸的合成有抑制作用，所以本研究考察了分批添加底物對D-苯基乳酸的產(chǎn)量以及轉(zhuǎn)化率的影響。在加入苯丙酮酸開始轉(zhuǎn)化反應(yīng)的1 h內(nèi)，苯丙酮酸快速轉(zhuǎn)化成D-苯基乳酸(圖5)，1～6 h內(nèi)D-苯基乳酸產(chǎn)量依然逐漸上升，6 h以后菌體轉(zhuǎn)化活力下降，D-苯基乳酸產(chǎn)量呈下降趨勢。反應(yīng)全過程共加入苯丙酮酸28 g。經(jīng)6 h全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，D-苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為18.47 g/L,轉(zhuǎn)化率為65.96%，生產(chǎn)率3.07 g/(L·g·h)。相比ZHENG等[11]報(bào)道用凝結(jié)芽孢桿菌(BacilluscoagulansSDM)全細(xì)胞生產(chǎn)D-苯基乳酸[產(chǎn)量 37.2 g/L，轉(zhuǎn)化率70%，生產(chǎn)率2.3 g/(L·h)]，本研究生產(chǎn)率提升了33.5%，但D-苯基乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率仍需進(jìn)步一提高。趙明月等[14]報(bào)道的將D-乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶在大腸桿菌中共表達(dá)，利用甲酸脫氫酶來提高胞內(nèi)輔因子水平，進(jìn)一步提高生物催化能力，經(jīng)分批補(bǔ)加苯丙酮酸，D-苯基乳酸產(chǎn)量累積達(dá)18.92 g/L，略高于本研究D-苯基乳酸總產(chǎn)量，說明在D-乳酸脫氫酶催化合成D-苯基乳酸的過程中，輔因子的再生對生物轉(zhuǎn)化作用顯著。

圖5　最適條件下分批補(bǔ)料添加苯丙酮酸鈉生產(chǎn)D-苯基乳酸時(shí)間曲線Fig.5　Time course of production of PLA from PPA by fed-batch under the optimum conditions

3　總結(jié)

D-乳酸脫氫酶是轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成D-苯基乳酸的關(guān)鍵酶，本研究將Lactobacilluspentosus的D-ldh 克隆到大腸桿菌中過表達(dá)。根據(jù)日本學(xué)者Ishikura等[15]和Tokuda等[16]的研究表明，將來自戊糖乳酸菌(Lactobacilluspentosus)D-乳酸脫氫酶催化位點(diǎn)第52位上的酪氨酸突變成亮氨酸后，該重組酶對苯丙酮酸的親和力上升了20倍，酶的催化效率提高了232倍。本研究利用PCR基因定點(diǎn)突變技術(shù)將D-乳酸脫氫酶第52位酪氨酸突變成亮氨酸。將D-苯基乳酸的產(chǎn)量提升到5.34 g/L，比未突變重組菌D-苯基乳酸的產(chǎn)量(3.66 g/L)增加了46%。我們進(jìn)一步對突變菌株誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件下，對突變重組菌進(jìn)行了底物流加培養(yǎng)，經(jīng)6 h全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，D-苯基乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為18.47 g/L，轉(zhuǎn)化率為65.96%。綜上，本研究構(gòu)建的突變重組大腸桿菌用于合成D-苯基乳酸，極大提高了D-苯基乳酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。而且大腸桿菌用于外源基因表達(dá)，具有遺傳背景清晰，生長周期短，培養(yǎng)條件簡單等優(yōu)點(diǎn)，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[19-20]。但是由于重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，重組菌在培養(yǎng)過程中可能會(huì)存在質(zhì)粒發(fā)生突變或丟失的情況, 使重組菌失去了原有的表型特征[21-22]。所以，為了進(jìn)一步提高大腸桿菌的生產(chǎn)效率和菌株的遺傳穩(wěn)定性，可以將經(jīng)過定點(diǎn)突變，能高效表達(dá)乳酸脫氫酶的基因整合到大腸桿菌基因組里。

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The recombinant expression ofD-lactic dehydrogenase mutantD-LDHY52L inE.coliand its application inD-phenyllactic acid synthesis research

JIANG Zhuo-yue1, JI Wei2, QIAN Bei-bei2, ZHU Yi-bo2*,QI Bin2

1 (School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, China) 2 (Research Center of Fermentation Engineering, Key Laboratory of Food and Biotechnology, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The three-dimensional structures ofD-lactic dehydrogenase fromLactobacilluspentosusimply that the side chain of 52 Tyr ofD-LDH can be located very near the C3 substituent group of 2-ketoacid substrate, thereby, associated with the recognition of substrate side chain. In this study, The replacement of hydrophilic Tyr 52 with hydrophobic Leu was done by the site-directed mutagenesis. The single amino acid replacement of Tyr52 with Leu significantly increased the affinity and activity toward phenylpyruvic acid. The mutantD-LDHY52L was over-expressed inEschrichiacoliBL21 (DE3). The whole cell transformation of PPA intoD-PLA was researched in this study .The results showed that production ofD-PLA was increased 46% by the mutant enzyme, compared to the native enzyme. The highest production ofD-PLA was 18.47g/L in the fed-batch transformation, and the conversion ratio was 65.96%.

D-lactic dehydrogenase; site-directed mutagenesis; recombinant expression; phenylpyruvic acid;D-phenyllactic acid

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601001

碩士研究生(朱益波教授為通訊作者,E-mail：centuryrain@126.com)。

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31470092)；江蘇省自然科學(xué)青年基金項(xiàng)目(BK20130380)；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(13KJB550002)；江蘇省“六大高峰人才”資助計(jì)劃項(xiàng)目(NY-021)；蘇州市科技支撐計(jì)劃(SNG201354)；常熟市科技計(jì)劃項(xiàng)目(CN201412)

2015-06-02，改回日期：2015-08-31