陳煒馬婉琳謝小紅伍紹國

運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結(jié)腸癥中的發(fā)病機制*

陳煒①馬婉琳①謝小紅①伍紹國①

目的：運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結(jié)腸癥（HD）中的發(fā)病機制。方法：選擇2014年1月-2015年12月，17例HD患兒作為病例組；與性別、年齡配對的17例非巨結(jié)腸手術(shù)患兒作為對照組，收集術(shù)中切除腸段，提取RNA并檢測SOX10表達水平。將人多潛能干細胞定向分化為神經(jīng)崤細胞，構(gòu)建SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)粒，檢測SOX10基因表達下調(diào)后，導(dǎo)入SOX10，再次檢測SOX10基因表達，與對照組相比上調(diào)后，觀察神經(jīng)崤細胞遷移能力。結(jié)果：病例組標(biāo)本檢測，痙攣段、移行段和擴張段SOX10/β-actni灰度值分別為（0.9254±0.2758）、（1.3082±0.0546）、（1.3147±0.0613），對照組為（1.3178±0.0715），痙攣段與正常腸段SOX10/β-actni灰度值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。移行段、擴張段與痙攣段SOX10/β-actni灰度值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與正常腸段比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。25μL SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)粒下調(diào)SOX10表達下調(diào)率為63.7%。加入促遷移因子laminin前，熒光顯微鏡下隨機視野計數(shù)結(jié)果顯示，神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量數(shù)為28%。加入后神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量數(shù)為65%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=12.829，P<0.05）。結(jié)論：SOX10在正常結(jié)腸組織中高表達，但在HD結(jié)腸痙攣段呈低表達，同時SOX10表達失調(diào)參與HD的發(fā)生和發(fā)展，運用人多潛能干細胞試驗證實下調(diào)SOX10可導(dǎo)致神經(jīng)崤細胞遷移障礙，而促遷移因子laminin可恢復(fù)其遷移能力。

人多潛能干細胞； SOX10； 先天性巨結(jié)腸癥； 發(fā)病機制

先天性巨結(jié)腸癥（Hirschsprung’s disease，HD）又稱先天性腸神經(jīng)節(jié)細胞缺乏癥[1]，臨床表現(xiàn)為小兒直腸或結(jié)腸遠端痙攣，出現(xiàn)排便障礙、無法排便，引起腸梗阻，嚴重的可致患兒死亡[2-3]。是一種常見的出生缺陷，發(fā)病率為0.02%～0.05%。到目前為止，HD的發(fā)病機制尚未完全闡明。有研究對患兒手術(shù)切除的發(fā)病腸段進行分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)節(jié)較少甚至缺失，使該腸段自主運動能力低下或缺失，從而發(fā)生腸畸形和痙攣，因此何種機制出現(xiàn)腸神經(jīng)節(jié)減少或缺失是先天性巨結(jié)腸癥發(fā)病機制的關(guān)鍵[4]。近年來有研究證實，HD患者存在SOX10基因突變，認為SOX10基因是參與腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要基因[5]。本研究通過HD結(jié)腸對正常結(jié)腸組織SOX10mRNA相對表達量的檢測，并運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結(jié)腸癥中的發(fā)病機制，旨在進一步闡明HD的病因，為治療提供參考，現(xiàn)報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 病例組：2014年1月-2015年12月，17例HD患兒手術(shù)標(biāo)本，男13例，女4例，年齡3 d～13個月，平均（4.7±1.4）個月，均為散發(fā)性，其中短段型10例，常見型6例，長段型1例，所有病例均無HD家族史，也未合并其他先天性畸形；對照組：以性別、年齡配對選取17例非巨結(jié)腸手術(shù)患兒正常結(jié)腸組織，男13例，女4例，年齡3 d～13個月，平均（4.5±1.2）個月，其中腸套疊腸壞死回結(jié)腸吻合術(shù)9例，肛門閉鎖行結(jié)腸造屢術(shù)4例，直腸閉鎖行結(jié)腸造屢術(shù)4例。兩組患兒年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 試驗經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員分批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意愿意接受研究并簽署知情同意書。入選標(biāo)準(zhǔn)：病例組患兒術(shù)后病理證實均為HD，對照組患兒術(shù)后病理證實均非HD；排除標(biāo)準(zhǔn)：其他先天性消化道畸形史患兒，家族性頑同便秘患兒。

1.3方法

1.3.1主要設(shè)備與試劑 電泳儀型瓊脂糖凝膠水平電泳裝置；德國Biometra公司PCR儀；PCR合成儀；SANYO -86 ℃超低溫冰箱；TGL-16G型臺式低速離心機；DK-SD電熱恒溫水槽水浴鍋；ZF型之外透射反射分析儀；Gene GeniuS成像分析系統(tǒng)；SK1311 Trizol RNA抽提試劑盒（美國GIBCO公司）；dNTP mix（美國Genview公司）；random primers（上海Sangon技術(shù)服務(wù)有限公司）；First-strand buffer（美國Gibeo公司）；Rnasin（美國MBI公司）；β-actin引物（上海Sangon技術(shù)服務(wù)有限公司）；DNA Marker DL2000bP（鄭州寶信生物科技有限公司）。

1.3.2標(biāo)本處理 術(shù)中立即取病變腸管，選取全層腸壁組織，無菌生理鹽水沖洗標(biāo)本后，棄去黏膜，無菌生理鹽水再次沖洗標(biāo)本組織后，置DEPC水消毒過的Ep管中，不用任何試劑固定，立即送-86 ℃恒溫冰箱中保存，并于2周內(nèi)做RT-PCR分析，以減少RNA降解；病例組所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)中診斷、術(shù)前X線檢查和術(shù)后常規(guī)組織學(xué)檢查。

1.3.3SOX10檢測方法 嚴格按試劑盒說明操作，提高組織總RNA，分別鑒定完整性和純度，計算RNA的 量。RNA量（pg/mL）=OD260×稀 釋倍數(shù)×40/2000，再按1OD260=40 μg RNA計算RNA產(chǎn)率。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增，最后進行PCR產(chǎn)物電泳分析，分別將5 μLβ-actni PCR、LSOX10PCR產(chǎn)物和1～2 μL上樣緩沖液混勻后注入加樣孔內(nèi)，電泳約20 min，分析觀察電泳結(jié)果并進行灰度掃描，應(yīng)用Gene GeniuS成像分析系統(tǒng)作半定量分析，以SOX10/β-actni灰度值比表示SOX10mRNA的相對表達量。

1.3.4SOX10對神經(jīng)崤細胞遷移的調(diào)節(jié)作用 將人多潛能干細胞定向分化為神經(jīng)崤細胞，檢測p75和AP2表達，確定定向誘導(dǎo)有效后，制備25 μL SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)，檢測SOX10基因表達下調(diào)后，p75/Ret免疫熒光染色標(biāo)記，計數(shù)神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量。加入促遷移因子laminin后，再次計數(shù)神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量。

1.4觀察指標(biāo) 比較病例組痙攣段、移行段、擴張段和對照組SOX10mRNA的相對表達量。同時觀察25 μL SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)致SOX10基因表達下調(diào)率；加入促遷移因子laminin后神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用x2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SOX10mRNA相對表達量比較 病例組痙攣段與正常腸段SOX10/β-actni灰度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。病例組移行段、擴張段與痙攣段SOX10/β-actni灰度值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與正常腸段比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1　兩組SOX10mRNA相對表達量比較（±s）

表1　兩組SOX10mRNA相對表達量比較（±s）

*與痙攣段比較，P<0.05

SOX10/β-actni灰度值痙攣段　移行段　擴張段　正常腸段病例組（n=17）　0.9254±0.2758　1.3082±0.0546*1.3147±0.0613*-對照組（n=17）　-　-　-　1.3178±0.0715 t值　16.204　1.207　0.568　-P值　0.000　0.093　0.647　-組別

2.2SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)對SOX10下調(diào)率的影響 25Μl SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)粒下調(diào)SOX10表達下調(diào)率為63.7%。

2.3加入促遷移因子laminin前后神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量觀察 加入促遷移因子laminin前，熒光顯微鏡下隨機視野計數(shù)結(jié)果顯示，神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量數(shù)為28%。加入后神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量數(shù)為65%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（x2=12.829，P<0.05）。

3　討論

腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）由神經(jīng)節(jié)細胞、致密的神經(jīng)纖維和特殊的膠質(zhì)細胞組成，神經(jīng)纖維連接各神經(jīng)節(jié)細胞，構(gòu)成完整的調(diào)節(jié)系統(tǒng)[6-10]，具有獨立控制胃腸蠕動，調(diào)節(jié)消化道吸收和分泌的重要功能。ENS源于神經(jīng)崤細胞巢，在胚胎發(fā)育早期，神經(jīng)管閉合后，其雙側(cè)細胞帶發(fā)育成神經(jīng)崤，當(dāng)神經(jīng)崤發(fā)育到一定階段，從神經(jīng)管分離出來后，神經(jīng)崤細胞開始向下遷移，部分細胞逐漸下降至咽囊段和軀干部，繼而遷移至各大臟器，最終定位于胚胎某一部位，形成神經(jīng)節(jié)細胞。因此推測先天性巨結(jié)腸癥（Hirschsprung’s disease，HD）的發(fā)病原因可能是神經(jīng)崤細胞在遷移和定位中受腸管微環(huán)境諸多因素的影響，出現(xiàn)遷移障礙，致神經(jīng)崤無法下降至大腸末端而致發(fā)病腸段神經(jīng)節(jié)細胞缺失，發(fā)生HD[11-13]。

DomSOX10是雜合子動物中產(chǎn)生致死性ENS表型的唯一被認識的基因突變。目前多數(shù)觀察認為HD腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)細胞缺失的原因是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果[14]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，己明確HD腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)細胞缺失與多種基因密切相關(guān)[15]。SOX10屬SOX家族，位于染色體22q13，參與細胞定向分化，干性維持和組織形成等，是一族進化過程中高度保守的基因，在神經(jīng)嵴、oligodendrocyte細胞、Schwann細胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的形成、成熟和終末分化中均發(fā)揮了重要作用，而SOX10突變可導(dǎo)致腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。同時國外研究證實，SOX10的未成熟終止突變可引起神經(jīng)崤細胞衍生物表達缺失，他們認為SOX10可能是不與其他易患基因相關(guān)的侯選突變位點[16-17]。動物實驗研究已證實，缺乏SOX10小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育停頓，表明小鼠SOX10基因中單個堿基的插入是突變體巨結(jié)腸表型的主要原因，并推測可能是突變的神經(jīng)崤細胞在其移行中早期過量死亡所致[18-19]。目前已證實人類嚴重的SOX10突變可導(dǎo)致HD、瓦爾敦堡綜合征個體及耳聾，提示其可能參與了調(diào)節(jié)突變的神經(jīng)崤細胞的早期發(fā)育和信號途徑，使其分化為腸神經(jīng)節(jié)細胞和黑色素細胞[12]。

Sham等[20]檢測了sox10在HD結(jié)腸和正常結(jié)腸中的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)腸中的表達明顯高于HD結(jié)腸。本研究結(jié)果顯示，病例組標(biāo)本痙攣段SOX10/β-actni灰度值為（0.9254±0.2758），明顯低于移行段、擴張段和正常腸段，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與Sham等[20]研究相符。說明在HD結(jié)腸段SOX10mRNA呈低表達，同時也說明SOX10基因不僅在胚胎時間對腸神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生影響，其在出生后也是維持腸神經(jīng)系統(tǒng)正常功能所必須的，一旦表達減少，則可能引起腸管痙攣，造成功能障礙。運用人多潛能干細胞，定向分化為神經(jīng)崤細胞，轉(zhuǎn)入SOX10 shRNA慢病毒質(zhì)后，SOX10表達率下降達63.7%，加入促遷移因子laminin前后，神經(jīng)嵴干細胞數(shù)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明SOX10在正常結(jié)腸組織中高表達，但在HD結(jié)腸痙攣段呈低表達。同時SOX10表達失調(diào)參與HD的發(fā)生和發(fā)展，運用人多潛能干細胞試驗證實下調(diào)SOX10可導(dǎo)致神經(jīng)崤細胞遷移障礙，而促遷移因子laminin可恢復(fù)其遷移能力。

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Using Human SOX10 Pluripotent Stem Cell Research in the Pathogenesis of Hirschsprung’s Disease

CHEN Wei，MA Wan-lin，XIE Xiao-hong，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：010-013

Objective：To apply SOX10 human pluripotent stem cell research in the pathogenesis of hirschsprung’s disease（HD）.Method：From January 2014 to December 2015，17 cases children with HD as a group.By gender，age，matching of 17 cases of children with hirschsprung surgery as the control group，collection of excision of the intestine， extracting RNA and detecting SOX10 expression level.Human pluripotentstem cells，directional differentiation into neural xiaohan cells， build SOX10 shRNA lentivirus plasmid，into SOX10 shRNA lentivirus plasmid，detect SOX10 gene expression after the downgrade，import SOX10，again to detect SOX10 gene expression，compared with the control group after raising，ability to observe neural xiaohan cell migration.Result：CPT samples，spas m，transitional period and the expansion period of SOX10/beta actni grey value were respectively （0.9254±0.2758），（1.3082±0.0546），（1.3147±0.0613） and the control group was （1.3178±0.0715），convulsion period and normal bowel SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.Transitional period，expanding period and spasm SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.There was no statistically significant difference compared with normal bowel（P>0.05）.25 μL SOX10 shRNA lentivirus cut SOX10 expression plasmid cut rate was 63.7%.Before joining migration factors laminin，fluorescence microscope counting random field of vision，according to the results of neural crest stem cell number count was 28%.After joining neural crest stem cell number count was 65%，the difference was statistically significant（x2=12.829，P<0.05）.Conclusion：SOX10 in normal colon tissue increases，but lower expression in HD colon spasms segment，the imbalance in SOX10 expresses the occurrence and development of HD，experiment using human pluripotent stem cells confirmed by SOX10 can cause nerve xiaohan cell migration barriers，and promote migration factor laminin can restore its ability to migrate.

Human pluripotent stem cells； SOX10； Congenital hirschsprung disease；Pathogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.003

2016-05-06） （本文編輯：程旭然）

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（WST JJ20140610430105198106043011）

①廣州市第十二人民醫(yī)院 廣東 廣州 510000

陳煒

First-author’s address：The Twelfth People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510000，China