胡麗娟，劉蔚，吳歡歡，李力，周愛軍，劉焱文*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430050；3.東莞市中醫(yī)院，廣東 東莞 523000)

加味小柴胡湯抗幽門螺桿菌的有效物質(zhì)部位群研究

胡麗娟1，劉蔚1，吳歡歡1，李力2，周愛軍3，劉焱文1*

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.武漢市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 430050；3.東莞市中醫(yī)院，廣東 東莞 523000)

目的：對加味小柴胡湯抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的有效物質(zhì)部位群進(jìn)行篩選研究，以期闡述其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為該經(jīng)典方劑治療胃潰瘍的臨床療效提供現(xiàn)代藥理學(xué)依據(jù)。方法：在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，將加味小柴胡湯復(fù)方視為整體，采用系統(tǒng)溶劑法提取分離為揮發(fā)油、生物堿類、酚酸類、皂苷類、多糖類等化學(xué)物質(zhì)部位；采用瓊脂擴(kuò)散法和液體稀釋法，考察該方劑及其各化學(xué)物質(zhì)部位對H.pylori 的抑菌圈直徑和最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。結(jié)果：全方水煎液組抑菌圈直徑(6.90±0.63)mm，MIC為0.125 g生藥·mL-1；揮發(fā)油物質(zhì)部位組(7.46±0.47)mm，MIC為0.500 g生藥·mL-1；生物堿物質(zhì)部位組(7.28±0.21)mm，MIC為0.130 g生藥·mL-1；酚酸類物質(zhì)部位組(7.46±0.10)mm，MIC為0.506 g生藥·mL-1；皂苷類物質(zhì)部位組(7.29±0.10)mm，MIC為0.246 g生藥·mL-1；總多糖物質(zhì)部位組沒有產(chǎn)生抑菌圈。結(jié)論：確定了加味小柴胡湯方中揮發(fā)油、生物堿類、酚酸類和皂苷類等物質(zhì)部位為抗H.pylori的有效物質(zhì)部位群。

加味小柴胡湯；幽門螺桿菌；有效物質(zhì)部位群；抑菌圈；MIC

幽門螺桿菌(H.pylori)是胃潰瘍和慢性胃炎疾患的病原體，也是導(dǎo)致胃癌和淋巴癌的重要病因。人類是H.pylori唯一天然宿主，因而胃潰瘍和慢性胃炎為常見病、多發(fā)病。我國是H.pylori感染高發(fā)地區(qū)，感染人群約占56.22%，其中西藏地區(qū)高達(dá)84.62%[1]，嚴(yán)重危害我國人民健康。因此，尋找抗H.pylori的藥物是醫(yī)藥科學(xué)工作者的重要研究課題。

加味小柴胡湯以張仲景所著《傷寒論》中小柴胡湯為基本方，加味干姜、黃連、白術(shù)、茯苓組成。東莞市中醫(yī)院周愛軍主任醫(yī)師長期臨床運用加味小柴胡湯治療胃潰瘍和慢性胃炎，療效顯著。本實驗在臨床療效基礎(chǔ)上，將加味小柴胡湯復(fù)方視為整體，采用系統(tǒng)溶劑法將其提取分離為揮發(fā)油、生物堿類、酚酸類、皂苷類、多糖類等部位；以抑菌圈直徑和最低抑菌濃度作為考察指標(biāo)，對各物質(zhì)部位進(jìn)行抗H.pylori篩選研究，確定了該方劑的有效物質(zhì)部位群。因此，本實驗為加味小柴胡湯用于治療胃潰瘍和慢性胃炎的臨床療效提供了科學(xué)實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱303A-3型(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；立式滅菌器LMQ.C型(寧波甬安醫(yī)療器械制造有限公司)；超純水機(jī)QYYS-20A型(重慶前沿水處理設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡BX41型(奧林巴斯)；-80 ℃立式超低溫保存箱DW-86L288型(Haier)等。

1.2 材料

微需氧產(chǎn)氣袋(三菱瓦斯化學(xué)株式會社)；哥倫比亞培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)、2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋、HB四連式牛津杯(青島海博生物技術(shù)有限公司)；無菌脫纖維綿羊血(平睿生物科技有限公司)。

1.3 質(zhì)控菌

幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種ATCC43504(上海北諾生物科技有限公司)。

1.4 供試藥物的制備

加味小柴胡湯全方水煎液的制備：按處方比例稱取一定量各味中藥，水煎煮提取，濃縮，干燥，研磨成藥粉。稱取藥粉適量，用雙蒸水溶解，定容至10 mL，配制成相當(dāng)于2 g生藥·mL-1的藥液，備用。

揮發(fā)油物質(zhì)部位藥液的制備：取處方量中藥，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。取揮發(fā)油適量，加100 μL聚山梨酯-80，繼加入雙蒸水定容至10 mL，配制成相當(dāng)于4 g生藥·mL-1的藥液，備用。

總多糖物質(zhì)部位藥液的制備：取加味小柴胡湯除黃連外組方的水煎液的濃縮液，少量多次加入95%乙醇，攪拌，使藥液中乙醇濃度達(dá)70%，靜置過夜，減壓抽濾，將醇沉物干燥，得總多糖物質(zhì)部位。取總多糖干浸膏粉適量，用雙蒸水定容至10 mL，配制成相當(dāng)于4 g生藥·mL-1的藥液，備用。

生物堿物質(zhì)部位藥液的制備：取上述抽濾后濾液適量，揮至無醇味，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH至10～11，用等體積的三氯甲烷萃取8次，合并三氯甲烷萃取液，減壓回收三氯甲烷，得三氯甲烷物質(zhì)部位；另按處方比例稱取黃連，用甲醇-鹽酸(100∶1)混合溶液超聲處理3次，每次30 min，合并黃連提取液，減壓回收溶劑，得黃連提取物；按處方比例稱取三氯甲烷萃取物和黃連提取物適量，混合，得生物堿物質(zhì)部位。取生物堿物質(zhì)部位干浸膏粉適量，加100 μL聚山梨酯-80，繼加入雙蒸水定容至10 mL，配制成相當(dāng)于4 g生藥·mL-1的藥液，備用。

酚酸類物質(zhì)部位藥液的制備：將上述三氯甲烷萃取后的水相用1mol·L-1HCL溶液調(diào)pH至3～4，用等體積乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓回收乙酸乙酯，得酚酸物質(zhì)部位。取酚酸物質(zhì)部位干浸膏粉適量，加100 μL聚山梨酯-80，繼加入雙蒸水定容至10 mL，配制成相當(dāng)于4 g生藥·mL-1的藥液，備用。

皂苷類物質(zhì)部位藥液的制備：將上述乙酸乙酯萃取后的水相用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH至中性，用等體積水飽和正丁醇萃取8次，合并正丁醇層，減壓回收正丁醇，得皂苷物質(zhì)部位。取皂苷物質(zhì)部位干浸膏粉適量，用雙蒸水溶解定容至10 mL，配制成相當(dāng)于4 g生藥·mL-1的藥液，備用。

1.5 陽性對照藥物的制備

稱取克拉霉素膠囊(江蘇亞邦愛普森藥業(yè)，批號：20140302)內(nèi)容物0.25 g，用雙蒸水溶解并定容至15 mL，備用。

2 方法[2-4]

2.1 選擇性培養(yǎng)基的配制

2.1.1 哥倫比亞液體培養(yǎng)基 稱取本品29.0 g，加熱溶解于1000 mL雙蒸水中，121 ℃高壓滅菌15 min，備用。

2.1.2 哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基 稱取本品39.0 g，加熱溶解于1000 mL雙蒸水中，121 ℃高壓滅菌15 min，冷至50 ℃左右時，加入5%無菌脫纖維綿羊血，混勻，趁熱傾入無菌平皿。

2.2 菌種的復(fù)蘇與培養(yǎng)

將H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株從-80 ℃冰箱取出，室溫放冷；取標(biāo)準(zhǔn)菌種100 μL置固體培養(yǎng)基中，用L型玻璃棒平鋪，再將培養(yǎng)皿裝入培養(yǎng)袋中，放入微需氧產(chǎn)氣袋，迅速密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)72 h。

2.3 菌液的制備及其濃度確定

刮除固體培養(yǎng)基上的菌苔，將其轉(zhuǎn)移至50 mL無菌的液體培養(yǎng)基中，作為原菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h，用0.9%氯化鈉溶液將菌液稀釋成10倍、100倍、103倍、104倍、105倍的菌懸液，搖勻，分別取稀釋的菌懸液各10 μL置固體培養(yǎng)皿中，用接種針劃“豐”字，再將培養(yǎng)皿裝入培養(yǎng)袋中，放入微需氧產(chǎn)氣袋，迅速密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)72 h；每個濃度平行試驗2次。采用菌落計數(shù)的方法，確定稀釋后的菌液的濃度，再選取合適的菌液濃度進(jìn)行體外抗菌試驗。

2.4 瓊脂擴(kuò)散法測定抑菌環(huán)直徑

取直徑90 mm、高度為16 mm的培養(yǎng)皿，傾注約15 mL熱融的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，待冷凝后，作底層；另取適量熱融的血瓊脂培養(yǎng)基，冷至50 ℃左右，加入適量菌懸液(約1 mL/皿，濃度為1×105CFU·mL-1)，搖勻后傾入培養(yǎng)皿中，約6 mL/皿，作為菌層；冷凝后，用無菌鑷夾取HB四連式牛津杯置于培養(yǎng)皿上，每孔加各物質(zhì)部位藥液100 μL，每個物質(zhì)部位重復(fù)3次；最后將培養(yǎng)皿裝入培養(yǎng)袋中，放入微需氧產(chǎn)氣袋，迅速密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)72 h；觀察并測量各部位藥液的抑菌圈大小。

2.5 液體稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)

取各試驗組藥液，用液體培養(yǎng)基稀釋至1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128等濃度，其中全方水煎液組從1∶1、1∶2開始稀釋；取各組稀釋后的藥液各1 mL，置于2 mL試管中，分別加入50 μL菌懸液(濃度為1×107CFU·mL-1)，每稀釋級重復(fù)2次。陽性對照管：1 mL液體培養(yǎng)基中加入50 μL菌懸液，使渾濁或有菌層；陰性對照管：2 mL液體培養(yǎng)基，應(yīng)澄清。最后將試管裝入培養(yǎng)袋中，放入微需氧產(chǎn)氣袋，迅速密封后置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)72 h；觀察藥液的渾濁情況，藥液渾濁說明有菌生長，藥液澄清且搖勻后仍澄清說明無菌生長，無菌生長的供試藥液最低濃度為該供試藥液的MIC。

3 結(jié)果

3.1 H.pylori 的菌落形態(tài)

光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)特征，呈“海鷗”狀或者彎曲的“S”，見圖1～2。

圖1 幽門螺桿菌培養(yǎng)菌落形態(tài)

圖2 幽門螺桿菌鏡檢圖

3.2 抑菌圈試驗測定結(jié)果

全方水煎液組、揮發(fā)油物質(zhì)部位組、生物堿物質(zhì)部位組、酚酸類物質(zhì)部位組、皂苷類物質(zhì)部位組都顯示出明顯抑菌效果，與陽性藥物克拉霉素比較無顯著差異；而總多糖物質(zhì)部位組沒有產(chǎn)生抑菌圈，顯示無抗幽門螺桿菌活性。提示加味小柴胡湯抗幽門螺桿菌的有效物質(zhì)部位群為揮發(fā)油類、生物堿類、酚酸類和皂苷類，結(jié)果見表1、圖3。

組別藥物濃度/g生藥·mL-1抑菌圈直徑/mm陽性對照組 0 0167g·mL-17 60±0 13全方水煎液組 2 006 90±0 63揮發(fā)油物質(zhì)部位組4 007 46±0 47生物堿物質(zhì)部位組4 157 28±0 21酚酸物質(zhì)部位組 4 057 46±0 10皂苷物質(zhì)部位組 3 947 29±0 10多糖物質(zhì)部位組 4 00—

注：1.全方水煎液組；2.揮發(fā)油組；3.生物堿組；4.酚酸組；5.皂苷組；6.多糖組；7.陽性對照組。圖3 加味小柴胡湯及其各物質(zhì)部位抑菌效果圖

3.3 MIC測定結(jié)果

采用倍比稀釋法對加味小柴胡湯及各物質(zhì)部位進(jìn)行最低抑菌濃度的測定，測定結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，全方水煎液組的MIC為0.125 g生藥·mL-1，生物堿物質(zhì)部位的MIC為0.130 g生藥·mL-1，皂苷物質(zhì)部位的MIC為0.246 g生藥·mL-1，揮發(fā)油部位的MIC為0.500 g生藥·mL-1，酚酸部位的MIC為0.506 g生藥·mL-1。

4 討論

目前臨床治療H.pylori感染疾患主要采用三聯(lián)治療方案，雖然取得了較好的治療效果，但隨著抗菌藥的耐藥性、不良反應(yīng)及復(fù)發(fā)率高等問題的出現(xiàn)，其對H.pylori感染疾患的效果已受到了明顯影響。因此，近年來很多學(xué)者開始關(guān)注中醫(yī)藥治療H.pylori感染疾患，體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療胃潰瘍和慢性胃炎疾患過程中有效物質(zhì)系統(tǒng)配伍協(xié)同作用的優(yōu)勢。據(jù)文獻(xiàn)報道，黃連、黃芩、茯苓、黨參、甘草等中藥具有抗H.pylori的藥效作用，小柴胡湯、半夏瀉心湯、四君子湯、黃連解毒湯等中藥復(fù)方治療H.pylori感染疾患具有較好的療效[5]。中醫(yī)臨床實踐證實，H.pylori感染所致胃潰瘍和慢性胃炎以濕熱型病例居多，其次為肝胃不和型[6]。加味小柴胡湯以柴胡為君藥引領(lǐng)和解表里、疏肝升陽之功效，配伍黃連、黃芩發(fā)揮清熱解毒功能，半夏、生姜、白術(shù)、茯苓的功效為燥濕化痰、解表散寒、補(bǔ)脾補(bǔ)氣，人參、大棗則加強(qiáng)補(bǔ)脾益氣，甘草調(diào)和方中諸藥。因此，加味小柴胡湯臨床用于治療胃潰瘍和慢性胃炎疾患符合中醫(yī)辨證的普遍規(guī)律。

表2 加味小柴胡湯及其各物質(zhì)部位的MIC實驗結(jié)果

注：+表示“渾濁”；-表示“澄清”。

本實驗在綜合分析加味小柴胡湯方中各藥化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，將該經(jīng)典方視為整體，根據(jù)各類化學(xué)成分理化性質(zhì)的特點，采用系統(tǒng)溶劑法將其提取分離為不同化學(xué)物質(zhì)部位。制備供試品溶液過程中，發(fā)現(xiàn)全方、皂苷和多糖部位的水溶性較好，但其他物質(zhì)部位水溶性較差，故考慮對水溶性較差的物質(zhì)部位，在供試品溶液制備過程中加入1%聚山梨酯-80助溶。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，70%以上濃度的聚山梨酯-80具有一定抑菌作用[7]。本實驗的供試品藥液制備過程中僅加入1%聚山梨酯-80助溶，因此推測對實驗結(jié)果影響甚微。由于培養(yǎng)H.pylori的固體培養(yǎng)基呈鮮紅色，進(jìn)行抑菌圈直徑測量時有背景干擾，故在測量抑菌圈直徑時，將培養(yǎng)皿放在菌落計數(shù)器的白光板上，打開白光燈，在白光板上用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。在較強(qiáng)白光照射下，背景干擾降低，可觀察到抑菌圈，抑菌圈直徑大小也可準(zhǔn)確測量。

通過抗H.pylori的篩選研究，確定了揮發(fā)油、生物堿、酚酸類、皂苷類等為有效部位群物質(zhì)系統(tǒng)。實驗結(jié)果表明，加味小柴胡湯及其有效物質(zhì)部位群與目前臨床用于治療胃潰瘍和慢性胃炎疾患的純陽正氣膠囊、清胃沖劑、雙黃連口服液等中成藥比較[8-9]，其抗H.pylori的作用類似；與陽性藥物比較，亦顯示良好抑菌效果，這對于闡釋該經(jīng)典方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要意義。加味小柴胡湯全方提取物與其有效物質(zhì)部位比較，前者抗H.pylori的效果優(yōu)于多數(shù)有效物質(zhì)部位，從而體現(xiàn)了中藥復(fù)方的配伍協(xié)同作用。因此，本實驗研究為加味小柴胡湯治療胃潰瘍和慢性胃炎的臨床療效提供了科學(xué)實驗依據(jù)，其有效物質(zhì)的作用機(jī)理和配伍協(xié)同作用有待進(jìn)一步深入研究。

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StudyonAnti-HelicobacterpyloriEffectiveFractionsofModifiedXiaoChaihuDecoction

HU Lijuan1，LIUWei1，WUHuanhuan1，LILi2，ZHOUAijun3，LIUYanwen1*

(1.HubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China；2.WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430050，China；3.DongguanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Dongguan523000，China)

Objective：To investigate the anti-helicobacter pylori effect of the Modified Xiao Chaihu Decoction and their isolated componentsinvitro.Methods：The means of systematic solvent extraction was used to separate volatile oils，alkaloids，phenolic acids，saponins and polysaccharides from the decoction.The inhibition zones of the decoction and their isolated components were surveyed through agar diffusion method，and the minimal inhibitory concentrations(MICs)were also determined by using fluid dilution method.Results：The bacterial inhibition diameter and MIC of the decoction were(6.90±0.63)mm and 0.125 g·mL-1of the crude drug，the bacterial inhibition diameter and MIC of the volatile oils were(7.46±0.47)mm and 0.500 g·mL-1of the crude drug，the bacterial inhibition diameter and MIC of the alkaloids were(7.28±0.21)mm and 0.130 g·mL-1of the crude drug，the bacterial inhibition diameter and MIC of the phenolic acids were(7.46±0.10)mm and 0.506 g·mL-1of the crude drug，the bacterial inhibition diameter and MIC of the saponins were(7.29±0.10)mm and 0.246 g·mL-1of the crude drug，the bacterial inhibition diameters of the polysaccharides was zero.Conclusion：The volatile oils，alkaloids，phenolic acids and saponins of the Modified Xiao Chaihu Decoction are anti-helicobacter pylor active fractions.

Modified Xiao Chaihu Decoction；Helicobacter pylori；effective fractions；bacterial inhibition diameter；MIC

2015-06-03)

*

劉焱文，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)；Tel：(027)88920834，E-mail： ywliu2008@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.011