馬維思，楊麗英，王馨，董志淵，李林玉，李紹平，嚴(yán)世武，楊斌

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

云南粗莖秦艽斑枯病病原鑒定△

馬維思，楊麗英，王馨，董志淵，李林玉，李紹平，嚴(yán)世武，楊斌*

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205)

目的：明確云南種植的粗莖秦艽斑枯病的發(fā)生規(guī)律及病原菌的分類(lèi)地位，以期為該病的防治提供依據(jù)。方法：通過(guò)田間調(diào)查掌握該病發(fā)生的基本規(guī)律，經(jīng)組織分離、柯赫氏法則驗(yàn)證獲得病原菌，依據(jù)真菌的形態(tài)特征和ITS序列特征確定其分類(lèi)地位。結(jié)果：基于真菌形態(tài)和ITS序列特征，粗莖秦艽斑枯病病原被鑒定為小孢殼針孢Septoriamicrospora，該病在云南粗莖秦艽主要種植區(qū)普遍發(fā)生。結(jié)論：小孢殼針孢Septoriamicrospora是粗莖秦艽斑枯病病原菌。

粗莖秦艽；斑枯??；病原鑒定；小孢殼針孢

1 材料與方法

1.1 材料

粗莖秦艽斑枯病病株與接種用健康植株均采自麗江市玉龍縣魯?shù)猷l(xiāng)拉美榮村粗莖秦艽基地，經(jīng)云南省農(nóng)科院藥用植物研究所李紹平研究員鑒定為粗莖秦艽Gentianacrassicaulis。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯去皮切塊浸煮，濾除殘?jiān)?0 g葡萄糖，17 g瓊脂，加水定容至1 L，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基為PD培養(yǎng)液。

Omega D3390-02真菌DNA小量提取試劑盒(廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司)；2X PCR Master(Taq，染料)即用PCR擴(kuò)增試劑盒[生工生物工程上海(股份)有限公司，簡(jiǎn)稱(chēng)生工生物]；真菌ITS通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′)與ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3′)由生工生物合成。

1.2 方法

1.2.1 病害調(diào)查 2013—2014年，在粗莖秦艽不同生長(zhǎng)期，通過(guò)田間觀(guān)察與走訪(fǎng)，對(duì)云南麗江市玉龍縣、迪慶州維西縣等粗莖秦艽主產(chǎn)區(qū)的斑枯病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，了解該病的發(fā)生規(guī)律。

1.2.2 病原菌的分離與形態(tài)鑒定 從病葉上采集病原物，在顯微鏡(鳳凰PH100-3B41L-IPL)下，用顯微鏡攝像頭(MC-D500U(C))拍照記錄其特征，用Phmias2008 Cs ver3.0圖像處理軟件，分別測(cè)量50個(gè)分生孢子器和孢子的大小。采用組織分離法，從葉片病斑的病健結(jié)合處，剪取5 mm2左右的小塊，用有效氯含量4.8%～6%的84消毒液分別浸泡40、60、80、100 s進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水沖洗3次，將4片相同消毒時(shí)間的組織小塊置于同一PDA平板上培養(yǎng)，將長(zhǎng)出的真菌轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，與病葉上病原物特征一致的真菌初步視為粗莖秦艽斑枯病病原菌，用于致病性測(cè)定。

1.2.3 致病性測(cè)定 取3盆3年生健康粗莖秦艽，每盆2株，從PDA平板上取真菌孢子配成濃度1×106個(gè)孢子·mL-1的孢子液，用毛筆將孢子液刷到葉片上進(jìn)行接種，另取3盆植株刷清水作對(duì)照。將對(duì)照和接菌植株置于人工氣候箱(上海一恒MGA-400H型)中，25 ℃、95%相對(duì)濕度，12 h光照、12 h黑暗培養(yǎng)，持續(xù)觀(guān)察30 d。對(duì)發(fā)生斑枯病的病葉進(jìn)行病菌再分離，與接種菌進(jìn)行形態(tài)比較，依據(jù)柯赫氏法則確定病原菌。

天空中飄下了一抹水色，氣騰騰的，像霧，像雨，又像風(fēng)。不一會(huì)兒，一片天都變得灰蒙蒙的，無(wú)論是城市還是背影，在茫茫的煙水里連魁梧的輪廓都混沌了，更別提辨出誰(shuí)是誰(shuí)的寄托。

1.2.4 病原菌的分子鑒定 從PDA平板上挑取菌塊，接種到含PD培養(yǎng)液的三角瓶中，25 ℃、140 r·min-1搖床培養(yǎng)120 h。培養(yǎng)好的菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取沉淀。根據(jù)Omega D3390-02真菌DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取，以真菌ITS4、ITS5為引物，用PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增病原菌的ITS序列。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，54 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃補(bǔ)平5 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物送生工生物進(jìn)行雙向測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中，選擇已公開(kāi)發(fā)表的、ITS序列相似度最高的10株菌，與粗莖秦艽斑枯病病原菌進(jìn)行比較，經(jīng)過(guò)CLASTALX 1.83進(jìn)行序列比對(duì)，利用MEGA6軟件，采用NJ(鄰接法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以確定病原菌的分類(lèi)地位，系統(tǒng)樹(shù)各分支的置信度用bootstra Ptest(自舉檢驗(yàn)法)檢驗(yàn)，共進(jìn)行1000次循環(huán)，根據(jù)Kimura-2參數(shù)計(jì)算各株遺傳距離值。

2 結(jié)果與討論

2.1 病害調(diào)查結(jié)果

粗莖秦艽一般播種育苗1年后移栽，移栽2～3年后采挖，經(jīng)調(diào)查，在云南麗江市玉龍縣、迪慶州維西縣等主產(chǎn)區(qū)，1年生粗莖秦艽很少發(fā)生斑枯病，2～4年生植株均發(fā)病普遍，嚴(yán)重地塊植株發(fā)病率高達(dá)100%。病原菌在植株殘?bào)w上越冬，來(lái)年4月份新葉展開(kāi)后即可見(jiàn)零星侵染，雨季到來(lái)后病情逐漸加重，其中8至9月發(fā)病最嚴(yán)重，斑枯病在田間常與銹病同時(shí)發(fā)生，一般不造成植株死亡，但導(dǎo)致葉片大面積枯萎，影響植株生長(zhǎng)。

病害一般從近地面老葉的葉尖、葉緣開(kāi)始發(fā)生，初生黃色、褐色小點(diǎn)，后擴(kuò)大成近圓形不規(guī)則的病斑，病斑中央黃色至黃褐色，邊緣紅褐色，呈不明顯的輪紋，外緣有靛青色的暈圈，隨著病情加重，病斑擴(kuò)大連成片，造成葉片大面積枯黃死亡，后期病斑中央產(chǎn)生深褐色的分生孢子器，多呈環(huán)狀或片狀聚集在葉片正面，背面較少(見(jiàn)圖1A、B、C)。病斑上產(chǎn)生分生孢子器釋放出的分生孢子成為粗莖秦艽生長(zhǎng)期的傳染源。

注：A.田間發(fā)病癥狀；B.病斑；C.分生孢子器；D.病葉上分生孢子。圖1 粗莖秦艽斑枯病

2.2 病原菌的分離與形態(tài)鑒定

通過(guò)組織分離法獲得一種與葉片真菌孢子形態(tài)特征相似的真菌，編號(hào)CJQJ，依據(jù)柯赫氏法則，取CJQJ的孢子接種健康粗莖秦艽葉片，出現(xiàn)典型的斑枯病癥狀，而對(duì)照植株健康未見(jiàn)發(fā)病(圖2A)。從病斑上進(jìn)行病原物的二次分離，獲得與接種真菌形態(tài)特征一致的真菌，據(jù)此確定CJQJ為粗莖秦艽斑枯病病原菌。

病原菌CJQJ在葉片病斑上的分生孢子器呈扁球形，具1圓形孔口，分生孢子器初時(shí)透明，埋生于葉表皮下，逐漸成熟后顏色加深變成暗褐色并突破葉表皮，露出葉表皮的分生孢子器直徑75.9～230.8 μm、平均(127.9±29.3) μm(見(jiàn)圖1C)。分生孢子針形，直或彎，兩端尖，基部較圓，有1～5(多為3)個(gè)隔膜，長(zhǎng)16.2～29.4 μm、平均(22.1±2.8) μm，寬1.6～3.1 μm、平均(2.1±0.3) μm，孢子內(nèi)具油球(見(jiàn)圖1D)。

病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，25 ℃培養(yǎng)20 d后的菌落直徑1.6 cm，菌落隆起，正面紫灰色，背面紫色，菌絲生長(zhǎng)致密、具隔。將帶菌絲的菌塊轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上，2周后能在接種菌塊上產(chǎn)生大量分散的分生孢子器(見(jiàn)圖2B菌落中央的深色部分)，擴(kuò)散到新培養(yǎng)基上的菌落部分，只長(zhǎng)菌絲而不產(chǎn)生分生孢子器(見(jiàn)圖2B中灰白色的部分)。分生孢子器的形成首先是病原菌菌絲結(jié)集形成黑色乳突狀結(jié)構(gòu)，再?gòu)钠漤敹水a(chǎn)生近無(wú)色透明的分生孢子器，隨著體積的增加，分生孢子器顏色由無(wú)色透明逐漸變?yōu)槿饧t色，無(wú)明顯的孔口，成熟的孢子器最后液化釋放分生出孢子(見(jiàn)圖2C)。PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)長(zhǎng)出的分生孢子較病葉產(chǎn)生的分生孢子短且分隔較少，披針形或鐮刀形，長(zhǎng)10.3～21.2 μm、平均(14.1±2.3)μm，寬1.6～3.5 μm、(2.6±0.4) μm，1～4個(gè)隔，多為1個(gè)隔(見(jiàn)圖2D)。

依據(jù)寄主和真菌的形態(tài)特征，參考《中國(guó)真菌志》[4]，初步將粗莖秦艽斑枯病病原真菌鑒定為球殼孢目(Sphaeropsidales)殼針孢屬(Septoria)真菌小孢殼針孢S.microspora。

注：A.致病性測(cè)定；B.菌落特征；C.分生孢子器；D.分生孢子。圖2 致病性測(cè)定與PDA培養(yǎng)基上的病原菌特征

2.3 基于ITS序列的病原真菌鑒定

經(jīng)雙向測(cè)序獲得粗莖秦艽斑枯病病原菌CJQJ 533bp的ITS序列，提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，同源性最高的10株菌均為殼針孢屬Septoria，其中序列登錄號(hào)KC874679的菌株Septoriamicrospora與CJQJ菌株同源性最高，相似性達(dá)到99%，文獻(xiàn)記載KC874679為甘肅產(chǎn)秦艽GentianamacrophyllaPall.斑枯病的病原菌[5]。

以1株序列編號(hào)GU237772的殼二孢屬(Didymella)真菌為外群，從BLAST檢索結(jié)果中，選已公開(kāi)發(fā)表、且與CJQJITS序列相似度最高的10株菌，用MEGA6軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。粗莖秦艽斑枯病病原菌CJQJ與小孢殼針孢(S.microspora)KC874679關(guān)系最為密切，只有2堿基差異，處在同一分支，據(jù)此確定CJQJ的分類(lèi)地位為小孢殼針孢S.microspora，與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。

圖3 基于真菌ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討論

殼針孢(Septoria)引起的斑枯病是栽培龍膽科植物中較為常見(jiàn)的病害，鄢洪海等報(bào)道了龍膽草斑枯病由S.microsporaSpeg.和S.gentianaeThum.，S.gentinicolaBaudys et Picb 3種真菌引起，其中S.microspora是主要病原菌，危害性最強(qiáng)[6]。王艷、李金花等分別報(bào)道了甘肅栽培秦艽G.macrophylla、G.spp斑枯病的病原菌分別為S.microsporeSpeg.[5]和S.gentianaeThum.[7]。球殼孢目(Sphaeropsidales)真菌的分生孢子大小和顏色等特征在不同寄主植物可能出現(xiàn)比較大的差異，目前全世界報(bào)道的殼針孢屬(Septoria)有2000種以上，其中有些是同物異名[2]。在本研究中，云南粗莖秦艽斑枯病S.microspora在病葉上的分生孢子，形態(tài)特征與PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的孢子有較大差異，病葉上的孢子較長(zhǎng)、針形，分隔數(shù)多為3，與王艷報(bào)道的甘肅產(chǎn)秦艽G.macrophylla斑枯病病菌S.microspora相似[5]，ITS序列同源性達(dá)99%，只有2bp的差異，而PDA培養(yǎng)基長(zhǎng)出的孢子較短、披針形，多為1個(gè)隔，與李金花等報(bào)道的甘肅栽培秦艽G.spp斑枯病病原菌S.gentianae接近[7]，二者是否為同物異名需要進(jìn)一步研究確定。

粗莖秦艽以滇西北地區(qū)種植面積最大，基本為農(nóng)戶(hù)自發(fā)分散種植，病害防治做不到統(tǒng)防統(tǒng)治，無(wú)法從源頭上徹底消除病原，導(dǎo)致斑枯病普遍持續(xù)發(fā)生。實(shí)踐證明，適時(shí)施用合適的殺菌劑對(duì)該病具有很好的防治效果。病害發(fā)生前噴施代森錳鋅、福美雙等保護(hù)性殺菌劑進(jìn)行預(yù)防，病害發(fā)生后，噴施1～2次多菌靈、三唑酮等內(nèi)吸性殺菌劑，對(duì)粗莖秦艽斑枯病及伴生的銹病均有很好的控制作用。秋末粗莖秦艽地上部分枯萎后，及時(shí)清理并集中燒毀干枯殘?bào)w，可有效減少越冬病原，對(duì)控制來(lái)年病害的發(fā)生也有積極作用。

致謝：論文撰寫(xiě)過(guò)程中得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳君老師的親切指導(dǎo)，本研究所需實(shí)驗(yàn)儀器得到云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所季鵬章博士的直接幫助，在此致以謝意！

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：270-271.

[2] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：第62卷[M].北京：科學(xué)出版社，1988：68.

[3] 聶燕瓊，李海彥，孫娜，等.粗莖秦艽資源研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14(5)：37-40.

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PathogenIdentificationofGentianacrassicaulisLeafSpotinYunnanProvince

MA Weisi，YANGLiying，WANGXin，DONGZhiyuan，LILinyu，LIShaoping，YANShiwu，YANGBin*

(InstituteofMedicinalPlants，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming650205，China)

Objective：To identify the pathogen ofGentianacrassicaulisleaf spot in Yunnan province.Methods：The pathogen was isolated from leaf spot ofG.crasicauliswith Potato Dextrose Agar medium，tested and verified with Koch’s postulates，and identified Based on morphological and ITS DNA sequence.Results：The pathogen was identified asS.microspora.Conclusion：S.microsporais the pathogen ofG.crasicaulisleaf spot.

Gentianacrasicaulis；leaf spot；pathogen identification；Septoriamicrospora

2016-03-01)

云南省科技創(chuàng)新強(qiáng)省計(jì)劃項(xiàng)目(2014AE015)；云南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃(2015HB102)

*

楊斌，副研究員，研究方向：藥用植物規(guī)范化栽培；Tel：(0871)65033575，E-mail：yb0872@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.3.008