田鵬鵬，朱麗莎，艾　彪，馬　青，田　甜

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.眼科，湖北荊州 434000)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

1株陰溝腸桿菌臨床分離株對(duì)亞胺培南耐藥機(jī)制的研究*

田鵬鵬1，朱麗莎1，艾彪1，馬青1，田甜2△

(長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.眼科，湖北荊州 434000)

目的探討陰溝腸桿菌臨床分離株對(duì)亞胺培南的耐藥機(jī)制。方法采用微量肉湯稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC)值，用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶；PCR擴(kuò)增檢測(cè)碳青霉烯酶(blaKPC、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2)編碼基因和廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9)編碼基因；耐藥基因水平傳播采用質(zhì)粒結(jié)合試驗(yàn)。結(jié)果陰溝腸桿菌臨床分離株除對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星敏感及妥布霉素中介外，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物、慶大霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑等抗菌藥物均耐藥。改良Hodge試驗(yàn)為陽(yáng)性。PCR擴(kuò)增5種碳青霉烯酶基因和5種廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因，顯示blaTEM基因擴(kuò)增陽(yáng)性，其余基因擴(kuò)增陰性。質(zhì)粒接合試驗(yàn)成功傳遞了對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥性，接合子菌株相較于陰溝腸桿菌臨床株，呈現(xiàn)出低水平耐藥。結(jié)論此分離株產(chǎn)碳青霉稀酶，攜帶TEM基因，并可以經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)播散。

質(zhì)粒；腸桿菌，陰溝；接合試驗(yàn)；碳青霉稀酶；耐藥機(jī)制

由于抗菌藥物的廣泛使用，陰溝腸桿菌的耐藥菌株也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。目前陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制有3種：(1)碳青霉烯酶的產(chǎn)生，包括KPC酶、IMI酶、金屬酶(IMP酶、VIM酶)等；(2)外膜蛋白的缺失或數(shù)量的減少伴有質(zhì)?；蛉旧w介導(dǎo)高水平β-內(nèi)酰胺酶(AmpC酶、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶等)的持續(xù)產(chǎn)生；(3)藥物作用靶位的改變[1-5]。本研究主要探討本科室內(nèi)分離的1株陰溝腸桿菌對(duì)亞胺培南耐藥的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源亞胺培南耐藥的陰溝腸桿菌來(lái)源于住院患者的胸、腹腔積液。大腸埃希菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保存中心。利福平耐藥的大腸埃希菌EC600用于結(jié)合試驗(yàn)的受體菌，以及本科室已經(jīng)鑒定為亞胺培南敏感的陰溝腸桿菌。

1.1.2儀器和試劑Microscan Walkaways96SI微生物自動(dòng)鑒定儀(美國(guó)德靈公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；亞胺培南藥敏紙片(英國(guó)OXOID公司)；PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR引物(上海桑尼生物科技有限公司合成)；PCR反應(yīng)相關(guān)試劑[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法測(cè)定細(xì)菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),亞胺培南耐藥菌株經(jīng)紙片擴(kuò)散法進(jìn)一步確證，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2013。

1.2.2改良Hodge試驗(yàn)參照CLSI M100-S23的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改良Hodge試驗(yàn)。

1.2.3細(xì)菌總DNA的提取從37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)的血瓊脂平板上，挑取單個(gè)菌落2～4個(gè)，放入到500 μL生理鹽水中，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min，離心5 min，留取上清液即為模版。

1.2.4PCR擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因PCR引物序列參照文獻(xiàn)，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5質(zhì)粒接合試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[6],稍作改動(dòng),接合試驗(yàn)在肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行。(1)將供體菌和受體菌EC600分別劃線接種于血平板上，35 ℃孵育過(guò)夜。次日，挑取單個(gè)菌落分別接種于5.0 mL MH肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃震蕩培養(yǎng)4 h。(2)取各0.5 mL的供體菌和受體菌加入到4.0 mL LB肉湯中35 ℃靜置孵育過(guò)夜。(3)取0.1 mL的混合菌液涂布于含利福平(256 mg/L)和不同濃度梯度亞胺培南的MH平板上，濃度梯度為16、8、4、2、1 mg/L，35 ℃孵育過(guò)夜，同時(shí)用受體菌和供體菌做對(duì)照試驗(yàn)。(4)次日觀察篩選平板上是否有克隆生長(zhǎng)，篩選所得的接合子菌株用Microscan Walkaways 96SI鑒定。

2　結(jié)　　果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果陰溝腸桿菌分離株經(jīng)微量肉湯稀釋法測(cè)得對(duì)亞胺培南的MIC>8 μg/mL，為耐藥，然后經(jīng)手工KB法確證，得到其抑菌環(huán)直徑為10 mm，為耐藥，同時(shí)測(cè)得接合子和大腸EC600對(duì)亞胺培南的抑菌圈分別為12 mm和30 mm，見(jiàn)圖1。陰溝腸桿菌臨床分離株除對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星敏感及妥布霉素中介外，對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物、慶大霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑等抗菌藥物均耐藥。見(jiàn)表1。

表1　　陰溝腸桿菌及其接合子菌株的藥敏表型

2.2改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果改良Hodge試驗(yàn)如圖2所示，1為肺炎克雷伯桿菌臨床株改良Hodge試驗(yàn)陰性，2、3為陰溝腸桿菌分離株改良Hodge試驗(yàn)陽(yáng)性。

1：接合子菌株對(duì)亞胺培南的耐藥情況；2：供體菌陰溝腸桿菌對(duì)亞胺培南的耐藥情況；3：受體菌大腸EC600對(duì)亞胺培南的耐藥情況。

圖1紙片擴(kuò)散法結(jié)果

中間為厄他培南藥敏紙片。1:已知對(duì)亞胺培南敏感的臨床株，顯示結(jié)果為陰性；2、3：均為陰溝腸桿菌臨床分離株，顯示結(jié)果為陽(yáng)性。

圖2改良Hodge試驗(yàn)圖

2.3PCR擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因結(jié)果對(duì)陰溝腸桿菌臨床株進(jìn)行耐藥基因的擴(kuò)增，包括5種碳青酶烯酶基因blaKPC、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2和5種廣譜及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9。發(fā)現(xiàn)在此株陰溝腸桿菌中僅檢出blaTEM，凝膠電泳上明顯可見(jiàn)大小為630 bp的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

表2　　PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

續(xù)表2　　PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1：接合子菌株；2：陰溝腸桿菌臨床株；3、4：科室內(nèi)亞胺培南敏感的陰溝腸桿菌；5：大腸埃希菌EC600;M:Marker。

圖3陰溝腸桿菌菌株blaTEM擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4接合試驗(yàn)陰溝腸桿菌的接合試驗(yàn)成功，分離出接合子菌株，接合子菌株經(jīng)Microscan Walkaways 96SI鑒定為大腸埃希菌，其藥敏結(jié)果見(jiàn)表1，相較于陰溝腸桿菌臨床株，接合子菌株對(duì)慶大霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺、妥布霉素甲惡唑的藥敏結(jié)果均變?yōu)槊舾?，呈現(xiàn)出低水平耐藥。接合子菌株擴(kuò)增出TEM基因，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

3　討　　論

隨著抗菌藥物的大量使用以至于濫用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象日益加重。在社區(qū)或是醫(yī)院感染中，腸桿菌科細(xì)菌都是重要的病原菌，其多重耐藥菌如產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株常常會(huì)對(duì)常見(jiàn)抗菌藥物耐藥。碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)，常常作為多重耐藥的腸桿菌科細(xì)菌的最后一道防線。因此，對(duì)碳青霉烯類(lèi)耐藥的問(wèn)題理應(yīng)引起人們的高度重視。

目前碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物主要包括亞胺培南、美羅培南、厄他培南等，并且對(duì)于腸桿菌科細(xì)菌而言，若對(duì)厄他培南中介或是耐藥應(yīng)視為對(duì)亞胺培南和美羅培南同時(shí)耐藥[7]。

本研究從臨床中分離到的1株陰溝腸桿菌，藥敏結(jié)果顯示此株陰溝腸桿菌對(duì)亞胺培南耐藥，而且為多重耐藥菌株，僅對(duì)阿米卡星、氟喹諾酮類(lèi)敏感，對(duì)其他常見(jiàn)抗菌藥物均耐藥，因?yàn)閝nrB2和blaKPC可以共同存在于一個(gè)質(zhì)粒上，同時(shí)介導(dǎo)對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥和對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的敏感[8]。改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果顯示為陽(yáng)性，提示分離株可能產(chǎn)碳青霉烯酶或產(chǎn)多種β-內(nèi)酰胺酶合并外膜蛋白的缺失。本研究進(jìn)一步擴(kuò)增5種常見(jiàn)的碳青霉烯酶(blaKPC、blaIMP-1、blaIMP-2、blaVIM-1、blaVIM-2)基因和5種常見(jiàn)的廣譜和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(blaTEM、blaSHV、blaCTX-M-1、blaCTX-M-2、blaCTX-M-9組超廣譜β-內(nèi)酰胺酶)基因，發(fā)現(xiàn)此株陰溝腸桿菌為產(chǎn)blaTEM型廣譜酶，與文獻(xiàn)[9-11]檢出不盡一樣，提示陰溝腸桿菌的耐藥機(jī)制有地區(qū)和菌株來(lái)源的差異，有遺傳和抗菌藥物的選擇性等方面差異。通過(guò)對(duì)陰溝腸桿菌臨床株和接合子菌株的藥敏結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌臨床株成功地將對(duì)碳青霉烯類(lèi)和其他β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物的耐藥性傳遞給受體菌，未傳遞對(duì)氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑的耐藥性，推測(cè)該質(zhì)?？赡苤粩y帶介導(dǎo)編碼β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌藥物耐藥的基因，同時(shí)也不能排除接合子菌株不能表達(dá)對(duì)其他抗菌藥物的耐藥性。本研究對(duì)陰溝腸桿菌臨床株和接合子菌株對(duì)亞胺培南的耐藥性進(jìn)行比較，由于儀器技術(shù)原因其在MIC上均為大于8 μg/mL，未能更加細(xì)致區(qū)分，但通過(guò)紙片擴(kuò)散法測(cè)其抑菌圈大小，發(fā)現(xiàn)有微弱不同，前者為10 mm，后者為12 mm，以上均提示出質(zhì)粒介導(dǎo)的接合子菌株耐藥為低水平耐藥。

對(duì)陰溝腸桿菌而言，與細(xì)菌耐藥性相關(guān)的外膜孔道蛋白有OmpF和OmpC，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，陰溝腸桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥主要表現(xiàn)為OmpF外膜孔道蛋白的缺失[6],本實(shí)驗(yàn)由于條件限制，未進(jìn)行外膜蛋白的分析，有待進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要原因是產(chǎn)碳青霉烯酶，這些酶大多是由質(zhì)?；蚴强梢苿?dòng)的染色體介導(dǎo)，極易在不同菌屬種中傳播，造成對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥性播散。因此，臨床上需加強(qiáng)對(duì)耐藥菌株尤其是多重耐藥菌株的監(jiān)測(cè)及細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究，更加清楚地了解細(xì)菌耐藥性的傳播和作用機(jī)制，為臨床上預(yù)防多重耐藥菌的播散及新型抗菌藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)。同時(shí)臨床上要合理、正規(guī)、有效地使用抗菌藥物，來(lái)減緩碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥性的轉(zhuǎn)變。

[1]杜小幸，周志慧，俞云松，等．一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的IMI-1型碳青霉烯酶[J]．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2004，24(10)：65-68．

[2]張肖，宋詩(shī)鐸．2株陰溝腸桿菌臨床分離株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制的研究[J]．中國(guó)抗生素雜志，2011，36(4)：303-306,314．

[3]Blanco VM,Rojas LJ,De La Cadena E,et al.First report of a nonmetallocarbapenemase class a carbapenemase in an enterobacter cloacae isolate from Colombia[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(7):3457.

[4]Irene G,Maria S,Zoil C,et al.Characterization of a new integron containing blaVIM-1 and aac(6/)-Ⅱc in an enterobacter cloacae clinical isolate from Greece[J].J Antimicrob Chemother，2005,55(55):634-638.

[5]Queenan AM,Bush K.Carbapenemases:the versatile beta-lactamases[J].Clin Microbiol Rev,2007,20(3):440-458.

[6]蒯守剛，邵海楓，王衛(wèi)萍，等．大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制研究[J]．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2010，30(9)：829-833．

[7]Anderson KR,Lonsway DR,Rasheed K,et al.Evaluation of methods to identify the Klebesilla pneumoniae carbapenemase in enterobaeteriaceae[J].Clin Microbiol,2007,45(8):2723-2725.

[8]Chmelnitsky I,Navon-Venezia S,Strahilevitz J,et al.Plasmid-mediated qurB2 and carbapenemase gene blaKPC-2 carried on the same plasmid in carbapenem-resistant ciprofloxacin-susceptible enterobacter cloacae isolates[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(8):2962-2965.

[9]蔡加昌，周宏偉，陳功祥，等．一株耐碳青霉烯類(lèi)的陰溝腸桿菌的KPC酶檢測(cè)[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2008，88(2)：135-138．

[10].施德仕，邵海楓，王衛(wèi)萍，等.同一標(biāo)本分離的2株碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制相關(guān)性分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2011,31(5):417-420.

[11]Zurfluh K,Hachler H,Nuesch-Inderbinen M,et al.Characteristics of extend-spectrum β-lactermase and carbapenemase-producing enterobacteriaceae isolates from rivers and lakes in Switzerland[J].Appl Environ Microbiol,2013,79(9):3021-3026.

田鵬鵬(1987-)，檢驗(yàn)師，碩士，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。△

，E-mail:dmtt-316@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.036

R446.5

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1671-8348(2016)07-0970-04

2015-09-18

2015-11-26)