陳遠(yuǎn)春，代　英，鐘　敏

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科　400014; 2.重慶涪陵中心醫(yī)院兒科　408000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童保健科　400014; 4.兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　400014)

?

·技術(shù)與方法·

3例杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良家系基因診斷策略探討*

陳遠(yuǎn)春1,2，代英3,4，鐘敏1.4△

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科400014; 2.重慶涪陵中心醫(yī)院兒科408000；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童保健科400014; 4.兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室400014)

目的對(duì)3例既往多重PCR基因檢測(cè)陰性的杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)家系進(jìn)一步進(jìn)行基因診斷及家系成員遺傳指導(dǎo)。方法收集先證者及其家系成員的臨床資料和基因組DNA，多重連接依賴(lài)的探針擴(kuò)增(MLPA)或第2代高通量測(cè)序?qū)NA樣本進(jìn)行DMD基因突變檢測(cè)。結(jié)果家系1檢測(cè)到3名男性Exon 7缺失，2名女性雜合子攜帶者。家系2先證者chrX-32486626的Exon 23發(fā)現(xiàn)c.3127C>T，其母chrX-32486626存在c.3127C>T雜合突變，患兒母親目前孕中胎兒系女孩。家系3先證者chrX-32509581的Exon 20發(fā)現(xiàn)c.2411G>A，其母chrX-32509581存在c.2411G>A的雜合突變。結(jié)論MLPA或聯(lián)合第2代高通量測(cè)序能夠有效基因確診DMD患者及其家系成員，為遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

肌營(yíng)養(yǎng)不良，杜氏；基因；突變；高通量測(cè)序

杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(duchenne muscular dystrophy，DMD) 是由位于Xp21.2的DMD基因缺陷所致的X連鎖隱性遺傳病，活產(chǎn)男嬰發(fā)病率約1/(3 600～6 000)[1]。該編碼基因包含79個(gè)外顯子、78個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)啟動(dòng)子，已報(bào)道的基因突變多達(dá)7 000余種，突變類(lèi)型多樣：大片段缺失突變約60%，大片段重復(fù)占7%，微小缺失或插入占7%，單堿基點(diǎn)突變占20%，剪切位點(diǎn)突變占2%，還包括少量復(fù)雜突變和內(nèi)含子突變[2-5]。本研究中3例DMD家系既往多重PCR基因檢測(cè)均陰性，通過(guò)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)和第2代高通量測(cè)序最終找到致病的基因突變位點(diǎn)而確診，為家系成員遺傳咨詢(xún)及產(chǎn)前診斷提供了準(zhǔn)確依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料家系1,先證者1，男，6歲半，G7P5，否認(rèn)產(chǎn)傷窒息史，1歲3個(gè)月會(huì)走路。自4歲開(kāi)始漸漸出現(xiàn)肢體乏力，行走緩慢，鴨步，易跌跤，漸加重至蹲起困難，雙小腿增粗變硬。查體：營(yíng)養(yǎng)中等，鴨步，Gower征(+)，雙側(cè)腓腸肌中度肥大，觸之稍硬，雙下肢肌力Ⅳ級(jí)。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶4 050 U/L(參考值50～220 U/L)。重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院多重PCR檢測(cè)DMD基因熱點(diǎn)區(qū)域基因缺失未見(jiàn)異常。家系調(diào)查：患兒父母體健，非近親結(jié)婚，患兒大哥幼年有類(lèi)似病史，現(xiàn)在19+歲，已經(jīng)癱臥于床，全身肌肉萎縮。Ⅲ4(第3代第4名家系成員)現(xiàn)年3+歲，腓腸肌輕度肥大，肌力、肌張力尚正常。家系2,先證者2，男，7歲，2013年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床診斷為DMD，因患兒母親再次懷孕6個(gè)月，為評(píng)估此次懷孕胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)而來(lái)院復(fù)診。G1P1，無(wú)產(chǎn)傷窒息史。1歲半走路。近4歲開(kāi)始漸漸出現(xiàn)行走乏力，漸至蹲起困難，鴨步。查體：營(yíng)養(yǎng)尚可，心音有力，無(wú)心界擴(kuò)大，鴨步步態(tài)，Gower征(+)，雙側(cè)腓腸肌中度肥大，觸之稍硬，雙下肢肌力Ⅳ級(jí)。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶12 400 U/L；2013年重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院多重PCR基因檢測(cè)未見(jiàn)異常。家族史無(wú)異。家系3,先證者3，男，5歲，2015年初重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床診斷DMD，為進(jìn)一步了解再次生育后代患病風(fēng)險(xiǎn)而來(lái)院就診。患兒系G1P1，無(wú)產(chǎn)傷窒息史。1歲2個(gè)月走路。4歲半漸出現(xiàn)行走易累，上臺(tái)階乏力。查體：營(yíng)養(yǎng)尚可，未見(jiàn)鴨步步態(tài)，Gower征(±)，雙側(cè)腓腸肌輕度肥大，單足跳稍差。肌電圖示肌源性損害；血肌酸激酶5 100 U/L；2015年初重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院多重PCR基因檢測(cè)未見(jiàn)異常。家族史無(wú)異。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取患兒監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，所有研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)倫理研究委員會(huì)同意。取患兒及其父母親外周血各2 mL，家系1加取其他4位同胞兄弟姐妹、外祖父母及祖父母外周血各2 mL，乙二胺四乙酸鈉抗凝。用基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Midi Kit，Qiagen，Hilden，Germany)提取DNA。

1.2.2MLPA購(gòu)買(mǎi)荷蘭MRC-Holland公司檢測(cè)試劑盒SALSAP034和P035。根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，基因組DNA變性后與SALSA MLPA探針雜交，雜交時(shí)間16 h，加入連接緩沖液和連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后用ABI 3130基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，所得數(shù)據(jù)用Gene Marker v1.6軟件分析，通過(guò)計(jì)算健康對(duì)照人群平均擴(kuò)增峰值，對(duì)所擴(kuò)增峰值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，分析得出MLPA分析結(jié)果圖。每次MLPA檢測(cè)都包括一個(gè)健康對(duì)照樣本，檢測(cè)結(jié)果重復(fù)2次。發(fā)現(xiàn)致病的基因突變即確診，未發(fā)現(xiàn)異常的繼續(xù)進(jìn)行第2代高通量的測(cè)序。

1.2.3第2代高通量測(cè)序利用Covaris S220超聲波儀(massachusetts，USA)將先證者2和3基因組DNA打斷成200～250 bp的片段。將1 μg提純的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)并連接上標(biāo)記性接頭，完成單個(gè)患者的DNA建庫(kù)。用定制的基因片段捕獲芯片SureSelect DNA Target Enrichment Baits (Agilent Technologies，Santa Clara，USA)，與2～4個(gè)標(biāo)記好的患者DNA庫(kù)雜交16 h，除去未結(jié)合的片段。洗脫芯片特異性篩選的片段，再進(jìn)行雜交后擴(kuò)增，最后進(jìn)行高通量測(cè)序儀Illumina HiSeq2000 Analyzers (Illumina，San Diego，USA)連續(xù)測(cè)序200個(gè)循環(huán)，并用Illumina bcl2fastq Conversion (Version 1.8.4)讀出原始測(cè)序數(shù)據(jù)。用此前經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的過(guò)濾原則對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，生成雙端100 bp的過(guò)濾后數(shù)據(jù)。再將這些數(shù)據(jù)利用軟件(Burrows Wheeler Aligner Multi．Visionsoftware package)與參考序列[the reference human genome from the NCBI database(Build 37)]進(jìn)行比對(duì)，輸出測(cè)序結(jié)果。最后利用SOAPsnp軟件和Samtools pileup軟件找出點(diǎn)突變、微小缺失和插入。

1.2.4Sanger法驗(yàn)證對(duì)于先證者2和3發(fā)現(xiàn)的致病突變，在其所在片段上下游設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物做Sanger測(cè)序，所得結(jié)果與DMD基因標(biāo)準(zhǔn)序列(NG_012232．1)進(jìn)行比對(duì)，從而驗(yàn)證基因芯片捕獲和高通量測(cè)序的結(jié)果。兩位先證者的父母也進(jìn)行該法驗(yàn)證。

2　結(jié)　　果

家系1的家系圖如圖1所示，先證者1的MLPA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DMD基因Exon 7缺失。Ⅲ1和Ⅲ4均發(fā)現(xiàn)DMD基因Exon 7缺失，結(jié)合臨床均確診為DMD。Ⅰ4和Ⅱ2均系該Exon 7基因缺失雜合子攜帶者。

圖1　　先證者1家系圖

家系2和3 MLPA檢測(cè)未見(jiàn)致病的基因突變，故進(jìn)行第2代高通量測(cè)序。先證者2的檢測(cè)結(jié)果顯示：chrX-32486626位置Exon 23區(qū)域發(fā)現(xiàn)一處半合子突變：c.3127C>T。家系驗(yàn)證結(jié)果：其母chrX-32486626存在c.3127C>T的雜合突變，其父未見(jiàn)異常，見(jiàn)圖2～3?；純耗赣H到產(chǎn)科進(jìn)行醫(yī)學(xué)必要胎兒性別鑒定系女孩。先證者3結(jié)果：chrX-32509581位置Exon 20區(qū)域發(fā)現(xiàn)一處半合子突變：c.2411G>A。家系驗(yàn)證結(jié)果：其母chrX-32509581存在c.2411G>A的雜合突變，其父未見(jiàn)異常。查詢(xún)HGMDpro數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)先證者2和3的突變系致病突變。

突變位置用黑色虛線框出。

圖2患兒DMD基因chrX-32486626區(qū)域Exon 23:c.3127C>T

突變位置用紅色實(shí)線及箭頭標(biāo)出。

圖3患兒母chrX-32486626存在c.3127C>T的雜合

突變

3　討　　論

DMD是兒科常見(jiàn)的遺傳性神經(jīng)肌肉病，發(fā)病男性占絕大多數(shù)，女性常為攜帶者，約2/3 患兒的病變基因來(lái)自于母親，近1/3 病例系新發(fā)突變[6]。一般3～5歲發(fā)病，全身乏力呈進(jìn)行性加重，逐漸臥床，最終因心功能不全和(或)呼吸衰竭多于20歲左右死亡，嚴(yán)重影響兒童的身心健康[1-2]。近年來(lái)，隨著口服激素等治療方案的發(fā)展，患者的生存期和生活質(zhì)量較以往有了一定改善。但是，本病迄今為止仍缺乏有效的根治方法。因此，高效、準(zhǔn)確的基因診斷、攜帶者檢測(cè)及遺傳咨詢(xún)對(duì)有效減少新發(fā)病例至關(guān)重要[1-2,5]。

多重PCR是DMD的主要基因檢測(cè)手段，可診斷約30%～40%患者數(shù)的DMD基因外顯子熱點(diǎn)區(qū)域大片段缺失，但對(duì)于非熱區(qū)的外顯子缺失、非缺失突變和女性攜帶者不能檢測(cè)[7-12]。本研究的3個(gè)家系多重PCR檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)致病的基因突變位點(diǎn)，故進(jìn)行進(jìn)一步的基因分析。MLPA能有效檢測(cè)大片段缺失或重復(fù)突變，使基因確診率提高到70%左右[7-14]。家系1通過(guò)該技術(shù)確診包括先證者在內(nèi)的3名男孩均系DMD患者，同胞的2名姐妹均未攜帶致病基因，患兒母親及外婆系突變基因攜帶者，為患兒家系成員的診斷及遺傳咨詢(xún)提供了有力證據(jù)。但是，家系2和3仍未檢測(cè)到致病的基因突變位點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，通過(guò)多重PCR結(jié)合MLPA檢測(cè)，仍有占全部DMD致病突變30%左右的微小突變不能檢測(cè)到，近年來(lái)第2代高通量測(cè)序使得這部分微小突變檢測(cè)成為可能[7-12]。故家系2和3繼續(xù)進(jìn)行該2代測(cè)序，均發(fā)現(xiàn)先證者和攜帶者的致病基因突變位點(diǎn)。家系2的母親此次懷孕系女?huà)?，故可正常分娩。遺傳指導(dǎo)家系成員的生育風(fēng)險(xiǎn)，最大程度杜絕后代中本病的發(fā)生。家系3的先證者母親被證實(shí)系突變致病基因攜帶者，為后期的再次懷孕給產(chǎn)科提供了準(zhǔn)確的依據(jù)。本研究的3個(gè)家系診斷過(guò)程值得臨床醫(yī)生高度關(guān)注。

因此，掌握本病正確的基因診斷策略對(duì)每個(gè)醫(yī)務(wù)工作者都至關(guān)重要。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，對(duì)臨床表現(xiàn)和普通血生化檢測(cè)疑診DMD患者，先行多重PCR分析，陰性者再予MLPA，仍陰性但高度疑診患者，考慮第2代高通量測(cè)序。在檢測(cè)成本進(jìn)一步降低后，有望通過(guò)該單一檢測(cè)就能涵蓋幾乎全部的DMD突變類(lèi)型及其他上百種肌病的基因突變，縮短了診斷周期，為遺傳咨詢(xún)以及進(jìn)行產(chǎn)前診斷提供依據(jù)，使患者及其家系成員最大程度獲益。這在目前DMD尚缺乏有效根治手段的情況下意義尤其重大。

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Gene diagnosis in 3 family members of Duchenne muscular dystrophy

ChenYuanchun1,2,DaiYing3,4,ZhongMin1,4△

(1.DepartmentofNeurology,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;2.DepartmentofPediatrics,theCentralHospitalofFulin,Chongqing408000,China;3.DepartmentofChildHealth,Children′sHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400014,China;4.ChongqingKeyLaboratoryofPediatrics/MinistryofEducationKeyLaboratoryofChildDevelopmentandDisorders,Chongqing400014,China)

ObjectiveTo perform gene diagnosis of Duchenne muscular dystrophy(DMD) in 3 family members who were negative for DMD gene detected by multiplex PCR and to provide genetic counseling for their family members accordingly.MethodsThe clinical data and genomic DNA of patients and their family members were collected,DMD gene mutation were detected by multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA) or the 2nd generation of high-throughput sequencing.ResultsIn the first family,3 male patients were detected deletion of Exon 7 and 2 female were heterozygous carriers.In the second family,it was found in the proband that point mutation of c.3127C>T in the Exon 23 of chrX-32486626 and c.3127C>T heterozygous mutations was confirmed in his mother,the mother was pregnant with a girl.In the third family,point mutation of c.2411G>A was detected in the Exon 20 of chrX-32509581 in the proband and his mother had c.2411G>A heterozygous mutation.ConclusionMLPA or combining with the 2nd generation of high-throughput sequencing can offer effective gene diagnosis for the patients of DMD and their family members,and provide the basis for genetic counseling and prenatal diagnosis.

muscular dystrophy，Duchenne;gene;mutation；high throughput sequencing

陳遠(yuǎn)春(1978-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事兒科臨床診治工作?！?/p>

，E-mail:cy_zm11@126.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.07.020

R746.2

A

1671-8348(2016)07-0926-03

2015-09-08

2015-11-20)