謝澤新　楊楊　王金爍

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·論著·

消癌平輔助絲裂霉素對肺癌細胞化療增效的研究

謝澤新楊楊王金爍

目的通過消癌平聯(lián)合絲裂霉素對肺癌A549細胞增殖，細胞周期、凋亡及相關(guān)基因表達的影響，探討化療增效機制。方法MTT檢測消癌平(2、8、21 μl/ml)聯(lián)合絲裂霉素(2 μg/nl)對肺癌A549細胞生長抑制(聯(lián)合用藥A、B、C組)，并設(shè)立對照組、絲裂霉素組和消癌平組；流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡；RT-PCR檢測P53、CyclinD1基因表達。結(jié)果MTT檢測顯示在24、48、72 h聯(lián)合用藥A、B、C組OD(光密度)均比絲裂霉素低(P<0.05)；流式細胞術(shù)檢測表明消癌平、絲裂霉素與對照組相比，肺癌細胞均阻滯于G0/G1期，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聯(lián)合用藥組G0/G1期細胞比率、細胞凋亡率與絲裂霉素組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。消癌平組、絲裂霉素組與對照組比較，均能提高P53 mRNA 表達(P<0.05)，聯(lián)合治療組P53 mRNA 表達高于絲裂霉素組(P<0.05)。消癌平組、絲裂霉素組與對照組比較均能降低Cyclin D1基因的表達(P<0.05)。與絲裂霉素組比較，聯(lián)合用藥可顯著減低CyclinD1基因的表達(P<0.05)。結(jié)論消癌平輔助絲裂霉素對肺癌細胞化療增效可能與上調(diào)P53 mRNA表達，增強細胞凋亡作用，以及下調(diào)CyclinD1 mRNA表達，阻滯細胞周期于G0/G1期有關(guān)。

消癌平;絲裂霉素;細胞周期;凋亡;Cyclin D1;P5

研究顯示，60%～80%肺癌患者首診時已到中晚期,已失去手術(shù)機會[1]?；瘜W治療成為中晚期肺癌主要治療措施[2]。目前臨床上常常通過聯(lián)合用藥以增強化療效果，但經(jīng)常受限于化療藥物的副作用，化療治療失敗很高，肺癌多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是被認為是導(dǎo)致化療治療失敗的最主要原因之一[3]。而中藥作為中國國粹藥物，其“成本廉價、應(yīng)用歷史悠久、不良反應(yīng)少、殺癌譜廣、作用靶點較多、逆轉(zhuǎn)多重耐藥性”等優(yōu)勢。研究表明，消癌平可抑制癌細胞生長，并使細胞阻滯于G0/G1期，調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白，從而促進凋亡[4]。鑒于此，此次研究采用消癌平聯(lián)合絲裂霉素(阻滯于細胞周期G0/G1)，監(jiān)測其對肺癌A549細胞增殖，細胞周期、凋亡的影響，并以P53mRNA，CyclinD1 mRNA的為指標，探討化療增效機制。

1　材料與方法

1.1細胞株人肺腺癌細胞株 A549購中國科學院上海細胞庫

1.2主要材料與試劑見表1。

表1　本研究所用之要材料與試劑

1.3方法

1.3.1采用MTT法檢測消癌平聯(lián)合絲裂霉素對肺癌A549細胞增殖的影響:取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)期的肺癌A549細胞，常規(guī)消化，配成單細胞懸液,顯微鏡下計數(shù)，以每孔8 000～10 000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μl。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h細胞完全貼壁后，分別消癌平濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μl/ml。絲裂霉素濃度： 64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/ml，同時設(shè)陰性對照組，各孔最終體積為100 μl。每組均復(fù)5孔。培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)，37℃，4 h后終止培養(yǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,并記錄結(jié)果。采用Bliss法，借助SPSS 19.0計算出4組24、48、72 h IC50值，并繪制相應(yīng)的濃度-抑制率曲線。細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。聯(lián)合用藥方案:消癌平濃度分別為32、8、2 μl/ml，并與絲裂霉素2 μg/ml兩兩聯(lián)合用藥，并設(shè)立陰性對照組及絲裂霉素單藥組。觀察24、48、72 h，采用MTT法測量各組OD值，并計算出抑制率。

1.3.2流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期變化及凋亡的影響:取對數(shù)生長期的肺癌A549細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液(細胞終濃度為1×105/ml)后接種于培養(yǎng)瓶中，24 h細胞貼壁良好后，加入消癌平、絲裂霉素、消癌平與絲裂霉素組，藥物濃度均為4組72 h IC50，使終體積為4 ml，陰性對照組加等量的普通培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下孵育48 h后，常規(guī)消化，用預(yù)冷PBS溶液清洗1～2次， 70%的冷乙醇2 ml固定，4℃保存過夜。離心去乙醇，PBS清洗1次，將細胞重懸浮于250 μl結(jié)合緩沖液中，調(diào)整待測細胞的密度為1×106個/ml。加入PI(65 μg/ml)染液1 ml，4℃避光染色30 min，上機檢測,記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光,并用cell modifit軟件分析細胞周期。

1.3.3RT-PCR檢查各組細胞CyclinD1、P53等mRNA表達。

1.3.3.1取對數(shù)生長期的肺癌A549細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液(細胞終濃度為1×105/ml)后接種于培養(yǎng)瓶中，24 h細胞貼壁良好后，加入消癌平、絲裂霉素、消癌平與絲裂霉素組，藥物濃度均為4組72 h IC 50，使終體積為4 ml，陰性對照組加等量的普通培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下孵育48 h。

1.3.3.2逆轉(zhuǎn)錄：按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟提取。

1.3.3.3聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):按RT-PCR試劑盒操作步驟。見表2。

表2　RT-PCR引物及序列

1.3.3.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

1.3.3.5圖像結(jié)果分析:EB染色后在紫外燈下拍照，用凝膠成像系統(tǒng)掃描條帶灰度值，并以GAPDH灰度值作為參考定量標準，求得待測基因/GAPDH的比值作為待測基因mRNA的相對表達量。

2　結(jié)果

2.14組藥物抑瘤率隨時間變化趨勢在不同時間段，消癌平(2、8、32 μl/ml)聯(lián)合絲裂霉素的OD值均比單藥消癌組及絲裂霉素組低，其OD值隨濃度的增高而減小。見圖1。

圖1　4組藥物抑瘤率隨時間變化趨勢

2.24組作用48 h后對細胞周期和凋亡率的影響消癌平(2 μl/ml)、絲裂霉素(2 μl/ml)與對照組相比，肺癌A549細胞G0/G1期細胞百分比均明顯高于對照組(P<0.05)。聯(lián)合用藥顯示肺癌A549細胞G0/G1期細胞百分比與消癌平、絲裂霉素相比明顯增高(P<0.05)。消癌平、絲裂霉素凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。聯(lián)合用藥時，肺癌A549細胞凋亡率由4.68%、提升9.56%(P<0.05)。見表1，圖2、3。

表1　4組治療48 h后對細胞周期及凋亡率的影響　±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與消癌平組比較，#P<0.05；與絲裂霉素組,△P<0.05

圖2絲裂霉素聯(lián)合消癌平注射液作用于肺癌A549腫瘤48 h后對細胞周期的影響

圖3絲裂霉素聯(lián)合消癌平注射液作用于肺癌A549腫瘤48 h后對細胞凋亡的影響

2.34組作用48 h后對p53、CyclinD1 mRNA表達的影響消癌平(2 μl/ml)、絲裂霉素(2 μl/ml)與對照組相比均能提高p53mRNA表達，相對表達量分別為、0.53、0.09，P<0.05。聯(lián)合用藥時對p53mRNA表達均高于消癌平、絲裂霉素0.80 VS 0.25、0.45，P<0.05。消癌平、絲裂霉素與對照組相比均能降低CyclinD1 mRNA的表達，其相對表達量分別是:0.51、0.46、0.88，與對照組相比，P<0.05。聯(lián)合用藥組與絲裂霉素單藥比，可顯著減低CyclinD1基因的表達，0.26 VS 0.46，P<0.05。見圖4，表2。

3　討論

細胞周期是指連續(xù)分裂細胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷過程,即G1、S、G2和M期。癌基因與抑癌基因的突變致細胞周期失控、過度

圖4絲裂霉素聯(lián)合消癌平注射液作用于肺癌A549腫瘤48 h后對P53、CyclinD1 mRNA表達的影響

注：A：對照組，B：消癌平組，C：絲裂霉素組，D：消癌平組+絲裂霉素組

組別P53CyclinD1對照組0.09±0.020.88±0.09消癌平組0.25±0.03*0.51±0.08*絲裂霉素組0.53±0.05*0.46±0.05*消癌平+絲裂霉素組0.83±0.03*#△0.26±0.09*#△

注：與對照組比較，*P<0.05；與消癌平組比較，#P<0.05；與絲裂霉素組,△P<0.05

增殖，最終形成腫瘤，因此癌癥是一種細胞周期疾病[5]。細胞周期的關(guān)卡即轉(zhuǎn)換點，其中G0/S期和G2/M期最為關(guān)鍵。腫瘤細胞可以順利通過這兩個關(guān)卡，因此腫瘤細胞的特點是細胞周期運行失控[6]。本試驗消癌平(作用于G0/G1期)與絲裂霉素(作用于G0/G1期)聯(lián)合用藥對肺癌A549生長抑制率及細胞周期阻滯于G0/G1期的細胞數(shù)目明顯大于絲裂霉素及消癌平組。二者同作用于G0/G1期的不同化療藥物聯(lián)合用藥能夠提高其肺癌細胞的G0/G1的阻滯效應(yīng)。該結(jié)果與頡永樂等[7，8]研究結(jié)果一致。而趙可新等[9]研究表明作用于G0/G1期的吉西他濱和絲裂霉素聯(lián)合用藥，S期細胞比例升高到33.5%，與單藥吉西他濱(S期占27.2%)和絲裂霉素(S期占17.5.2%)具有明顯差異。表明共同作用于G0/G1期的不同化療藥物聯(lián)合用藥能夠未必能夠提高G0/G1期的阻滯效應(yīng)。

無論特異性周期化療藥物聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的阻滯于哪一期，最終均可以調(diào)控細胞周期機制來抑制增殖、促進凋亡。為此，本實驗選取具有代表性的P53凋亡基因、細胞周期蛋白D1基因(作用G0/G1期)作為實驗指標來進一步闡述上述作用機制。

細胞凋亡是通過基因編碼調(diào)控的使細胞主動自殺的過程，又稱程序性細胞死亡(programmedcell dath，PCD)，既是其維持自身穩(wěn)定、平衡的機制，亦是清除異常增殖細胞的有效途徑[10]。p53是研究最多的腫瘤基因，野生型p53抑癌基因使細胞周期發(fā)阻滯、誘導(dǎo)凋亡和促進分化。通過對細胞G1期的調(diào)控，發(fā)揮檢查點的職能，檢測DNA是否損傷，從而控制細胞進入S期，誘導(dǎo)DNA修復(fù)，如果失敗，則促使細胞凋亡，防止癌變。另一方面P53亦可通過激活TNF家族、Fas/Fasl、Bcl、bax等凋亡基因，促進癌變細胞凋亡，因此野生型P53具有“分子警察”之稱[11]。p53基因是人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因，特別是在非小細胞肺癌中的突變率超過50%[12,13]。

CyclinD1是細胞周期中的重要調(diào)控因子， CyclinD1是細胞周期G1/S期的調(diào)控蛋白，其基因和編碼蛋白的異常，以及與多種腫瘤相關(guān)基因的協(xié)同作用可促使細胞惡性轉(zhuǎn)化，CyclinD1 表達失控導(dǎo)致細胞增殖周期失調(diào)和腫瘤形成[14]。當CyclinD1擴增時，G1/S縮短，細胞持續(xù)增殖，致腫瘤的形成[15,16]。CyclinDl過度表達在很多腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，將其作為新的原癌基因[17]。本研究顯示消癌平聯(lián)合絲裂霉素不僅可以增強對肺癌A549細胞抑制率，亦可提高凋亡率及P53基因的表達量，表明消癌平協(xié)同絲裂霉素促進凋亡可能通過提高P53基因的表達實現(xiàn)的。該結(jié)論與張銳等[18]研究結(jié)果消癌平對肝癌細胞 Bel-7402的凋亡具有濃度依賴性，其P53蛋白的表達也隨著藥物濃度的增加而增加一致。但是消癌平除了誘導(dǎo)P53基因表達外，亦可影響凋亡相關(guān)蛋白的表達。如陳同生等[19]研究表明：消癌平作用于人肺腺癌(ASTC-a-1)可誘導(dǎo)了細胞內(nèi)caspase-3的顯著活化，誘導(dǎo)細胞凋亡。王思穎等[20]高劑量消癌平加奧曲肽抑制腫瘤生長可能與通過調(diào)控凋亡Bcl-2、Bax 的表達誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

為進一步明確其中相關(guān)機制，以CyclinD1(G0/G1期)的調(diào)控基因為指標，聯(lián)合用藥顯著降低CyclinD1基因的表達水平，表明消癌平聯(lián)合絲裂霉素提高對肺癌A549細胞周期G0/G1期阻滯效應(yīng)，作用機制可能與下調(diào)CyclinD1 mRNA有關(guān)，提高P53基因的表達量，誘導(dǎo)細胞凋亡。

本研究為探索中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌方案提供了實驗依據(jù)，同時，研究細胞單一,檢查的凋亡相關(guān)蛋白細胞周期相關(guān)蛋白較少,在以后的研究中值得深入探討。

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Effects of Xiaoaiping injection combined with mitomycin on lung cancer cells in vitro

XIEZexin*,YANGYang*,WANGJinshuo.

*DepartmentofCardiothoracicSurgery,TheThirdHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo observe the effects of Xiaoaiping injection combined with mitomycin on cell proliferation,cell cycle, cell apoptosis and expressions of related genes (CyclinD1,P53 mRNA) of lung cancer-A549 cells in vitro,and to explore potential action mechanism.MethodsThe inhibitory effects of Xiaoaiping injection (2,8,21μl/ml) combined with mitomycin (2μg/nl) were detected by MTT (combination treatment group A,B,C),moreover, control group, Xiaoaiping group and mitomycin group were established.The cell cycle and cell apoptosis of lung cancer-A549 cells in vitro were detected by cytometry,and the expression levels of CyclinD1 and P53 mRNA were measured by RT-PCR.ResultsThe results by MTT showed that the optical density value (OD) on 24h,48h,72h in combination treatment group A,B,C was significantly higher than that in mitomycin group (P<0.05).The results by cytometry showed that as compared with control group,the lung cancer cells were blocked at G0/G1 phase in Xiaoaiping group and mitomycin group (P<0.05). There were significant differences in the cell ratio at G0/G1 phase and cell apoptosis rate between combination treatment groups and mitomycin group (P<0.05). The expression levels of P53 mRNA in Xiaoaiping group and mitomycin group were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05). Moreover the expression levels of P53 mRNA in combination treatment groups were significantly higher than those in mitomycin group (P<0.05). The expression levels of Cyclin D1 in Xiaoaiping group and mitomycin group were significantly decreased,as compared with those in control group (P<0.05). Furthermore the expression levels of Cyclin D1 in combination treatment groups were significantly decreased,as compared with those in mitomycin group (P<0.05).ConclusionXiaoaiping injection combined with mitomycin can enhance the efficiency of chemotherapy on lung cancer-A549 cells in vitro,and the action mechanism may be correlated to up-regulating the expression levels of P53 mRNA,increasing cell apoptosis and down-regulating the expressions of CyclinD1 mRNA to block cancer cells at G0/G1 phase.

Xiaoaiping injection;mitomycin; cell cycle;apoptosis; CyclinD1; P5

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.18.004

050011河北省石家莊市第三醫(yī)院心胸外科(謝澤新、楊楊)，腫瘤科(王金爍)

R 734.2

A

1002-7386(2016)18-2737-04

2016-01-11)