張媛媛，徐雅萍，杜鵬程，強(qiáng)?？?，張　雯，陳　晨，于季紅，郭　軍

1中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所　傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 1022062首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院　傳染病研究所，北京 1000153解放軍總醫(yī)院　南樓臨床部檢驗科，北京 1008534清華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心　北京清華長庚醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 1022185解放軍總醫(yī)院　南樓臨床部呼吸內(nèi)科，北京 100853

?

·論著·

老年住院患者肺炎克雷伯菌臨床分離株多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列基因分型特征分析

張媛媛1，2，徐雅萍3，杜鵬程1，2，強(qiáng)?？?，張雯1，陳晨2，于季紅3，郭軍4，5

1中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 1022062首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 1000153解放軍總醫(yī)院南樓臨床部檢驗科，北京 1008534清華大學(xué)醫(yī)學(xué)中心北京清華長庚醫(yī)院呼吸內(nèi)科，北京 1022185解放軍總醫(yī)院南樓臨床部呼吸內(nèi)科，北京 100853

目的探討老年住院患者肺炎克雷伯菌分離株多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析的基因分型特點(diǎn)。方法收集解放軍總醫(yī)院南樓臨床部老年住院患者肺炎克雷伯菌臨床分離菌株184株，提取基因組DNA，采用多重PCR和毛細(xì)管電泳對7個位點(diǎn)進(jìn)行分析，利用BioNumerics 5.1軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果184株肺炎克雷伯菌臨床分離株共產(chǎn)生139種基因型，呈現(xiàn)明顯的基因多態(tài)性；聚類分析結(jié)果顯示，全部菌株可分為3個基因群，其中Ⅰ群包含93.06%的菌株。結(jié)論本醫(yī)療中心老年住院患者的肺炎克雷伯菌臨床分離株具有明顯的優(yōu)勢菌群，其感染來源仍以院內(nèi)感染為主。

老年住院患者；感染；肺炎克雷伯菌；多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析

2Institute of Infectious Diseases，Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China

3Department of Clinical Laboratory in South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

4Department of Respiratory Medicine，Beijing Tsinghua Changgung Hospital，

Medical Center，Tsinghua University，Beijing 102218，China

5Department of Geriatric Respiratory Medicine in South Building，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China

ActaAcadMedSin，2016,38(4)：434-437

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia，KP)是一種常見的革蘭陰性人類機(jī)會性病原菌，在臨床各種標(biāo)本中檢出率較高，常在免疫力低下宿主引起各種社區(qū)或醫(yī)院獲得性感染(包括肺炎、尿路感染、血流感染、腦膜炎和腹腔感染等)[1- 2]。對導(dǎo)致醫(yī)院獲得性感染的菌株進(jìn)行分型，對指明可能的傳播途徑是不可缺少的技術(shù)手段。早期常應(yīng)用脈沖場凝膠電泳對KP進(jìn)行分型[3]，此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不依賴于序列分析和分辨率高，缺點(diǎn)是費(fèi)力且不能夠?qū)Σ煌瑢?shí)驗室間的結(jié)果進(jìn)行比對。隨后出現(xiàn)的是多位點(diǎn)序列分型技術(shù)[4]，它需要針對7個管家基因進(jìn)行PCR和雙向測序，使得對大批量菌株進(jìn)行流行病學(xué)分析耗時且花費(fèi)較高。KP分子流行病學(xué)研究亟需應(yīng)用簡便、快捷和花費(fèi)相對低廉的新分型方法。KP和許多種類的細(xì)菌基因組一樣，都包含可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable numbers of tandem repeats，VNTR)[5]。與多位點(diǎn)序列分型一樣，VNTR分析和多位點(diǎn)VNTR分析(multiple locus VNTR analysis，MLVA)對細(xì)菌基因分型十分有用，可提供便攜的結(jié)果用于實(shí)驗室間相互比對和數(shù)據(jù)庫登記。Turton等[6]于2010年首先報道將VNTR分析方案應(yīng)用于KP分子分型。2014年，Brink等[7]應(yīng)用MLVA技術(shù)進(jìn)行KP院內(nèi)傳播的溯源分析，為KP的院內(nèi)感染控制提供了一種簡便、可靠的新型關(guān)鍵性技術(shù)。老年住院患者發(fā)生院內(nèi)感染的機(jī)會較大，尤其是KP感染率高，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，不易治愈[8]，老年住院患者自然成為KP院內(nèi)感染控制的重要目標(biāo)監(jiān)測人群。本研究利用MLVA技術(shù)，對分離老年住院患者的KP菌株進(jìn)行分子分型，為科學(xué)有效控制KP的院內(nèi)傳播提供依據(jù)。

材料和方法

菌株來源與鑒定KP臨床菌株分離自2008年1月至2014年1月，全部來自解放軍總醫(yī)院南樓臨床部184例老年住院患者。由臨床醫(yī)生根據(jù)臨床癥狀留取相應(yīng)部位標(biāo)本(痰液、尿液、血液等)并收集病例的背景資料，檢驗科進(jìn)行細(xì)菌分離和培養(yǎng)，使用API系統(tǒng)(生物梅里埃公司，法國)對分離菌株進(jìn)行菌種鑒定，被鑒定為肺炎克雷伯菌肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniae，KPP)的菌株均納入本研究。

多重PCR和毛細(xì)管電泳菌株經(jīng)熱滅活后，用DNA提取試劑盒(Qiagen)提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。多重PCR引物序列和熒光標(biāo)記信息見表1。PCR反應(yīng)體系采用20 μl體積，包括Taq酶反應(yīng)預(yù)混液(含染料)(2×)(ThermoScience)10 μl，7對引物混合物(4 μmol/L)8 μl，DNA模板1 μl，以及去離子水1 μl。反應(yīng)條件為，預(yù)變性95℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，延伸68℃ 30 min[5]。獲得PCR產(chǎn)物采用ABI 3730基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果用Gene-Mapper軟件進(jìn)行分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小計算該位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)。

聚類分析使用BioNumerics(Version 5.1)軟件進(jìn)行聚類分析，聚類方法為平均連鎖聚類法，基因型完全一致的菌株定義為一簇，與本研究內(nèi)任何菌株基因型均不一致的基因型定義為單一基因型。計算各位點(diǎn)等位基因多樣性(h)以及7個檢測位點(diǎn)的Hunter-Gaston分辨率指數(shù)[9]。采用Hawkey等[10]對等位基因多態(tài)性的分級標(biāo)準(zhǔn)確定各位點(diǎn)的多態(tài)性分辨能力級別。

結(jié)　　果

菌株一般情況共納入184株KPP，菌株分離自2008至2014年共184例住院患者，當(dāng)1例病例分離多株KPP時，僅納入首次分離的菌株。184株KPP中，125株(67.9%)分離自呼吸道標(biāo)本(痰液)，41株(22.3%)分離自泌尿系統(tǒng)(尿液或尿道分泌物)，其余分離自血液、膽汁、胃液和腹腔引流液。184例住院患者中，80～89歲患者114例(62%)，患者數(shù)最多，全部患者均大于60歲。

等位基因多態(tài)性通過計算各位點(diǎn)等位基因多樣性(h)，可見各位點(diǎn)的等位基因多態(tài)性即h具有較大差異。等位基因多態(tài)性最高的位點(diǎn)是27#位點(diǎn)(h=0.8751)。根據(jù)等位基因多態(tài)性的分級標(biāo)準(zhǔn)，本研究涉及的位點(diǎn)中4個(27#、45#、52#和60#)為高分辨能力位點(diǎn)(h>0.6)，3個為中等分辨能力位點(diǎn)(0.3≤h≤0.6)(表1)。7個位點(diǎn)的Hunter-Gaston分辨率指數(shù)為0.9942。

MLVA分型經(jīng)MLVA分型分析，184株KPP共產(chǎn)生139個MLVA型別，呈明顯的多態(tài)性。以100%相似值水平進(jìn)行分析，70株(38.04%)KPP為單一基因型，114株(61.96%)分屬于25個型別，各型別包含2～10株KPP，包含菌株最多的1個型別(3- 4- 4- 1- 2- 1- 6)有10株，占所有菌株的5.43%。將差異位點(diǎn)數(shù)≤2的菌株進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示184株KPP中的173株可分為3個基因群(Ⅰ～Ⅲ群)，其中包含菌株數(shù)量最多的基因群為Ⅰ群，共161株(93.06%)，Ⅱ群包含10株(5.78%)，Ⅲ群包含2株(1.15%)(圖1)。

討　　論

在我國，目前克雷伯菌屬是僅次于大腸桿菌的最重要的條件致病菌，其導(dǎo)致的醫(yī)院獲得性感染發(fā)病率較高，其中又以KPP最為常見。老年住院患者常因自身免疫功能下降，長期使用抗生素，接受有創(chuàng)性操作和住院時間較長等因素，成為KPP感染的目標(biāo)人群[8]。利用MLVA分型技術(shù)對老年住院患者臨床樣本中分離的KPP進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，可以幫助認(rèn)識KPP的傳播過程與特點(diǎn)，為更好地控制KPP的院內(nèi)傳播提供新型監(jiān)測方法。MLVA分型方法具有操作簡單、結(jié)果數(shù)字化、易于分析、分辨率高和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為確定菌株間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)手段，可用于探索菌株間的相關(guān)性、追溯傳染源、傳播過程等，尤其適用于短期內(nèi)暴發(fā)流行的調(diào)查[5]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以多重PCR和毛細(xì)管電泳片段掃描為基礎(chǔ)的MLVA實(shí)驗流程，為這種方法的推廣應(yīng)用以及標(biāo)準(zhǔn)化提供更好的解決方案[7]。

對本研究中涉及的7個位點(diǎn)的多態(tài)性指數(shù)(h值)進(jìn)行計算，6個位點(diǎn)的多態(tài)性與國外報道[7]近似，51#位點(diǎn)的多態(tài)性(h=0.3466)明顯偏低，這可能是因為

表 1　多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析分型方法的VNTR位點(diǎn)信息和引物序列Table 1　VNTR information and primer sequence for the multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis scheme

VNTR：可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列；FAM：羧基熒光素；VIC：綠色熒光蛋白

VNTR： variable numbers of tandem repeats；FAM：carboxyfluorescein；VIC： green fluorescent protein

圖 1173株肺炎克雷伯菌最小生成樹

Fig 1Minimum spanning tree of 173klebsiellapneumoniastrains by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis

本院具有的主要流行菌株本身的同源性比較高，與國外研究中選取的菌株分屬不同的進(jìn)化分枝有所不同。這一結(jié)果提示，應(yīng)根據(jù)我國主要流行菌株的基因組信息進(jìn)行深入分析和擴(kuò)大菌株樣本量的實(shí)驗驗證結(jié)果，選取合適的位點(diǎn)形成我國的KPP菌株基因分型技術(shù)方案。通過MLVA分型，KPP菌株可分為3個基因群，其中161株菌株聚集在Ⅰ群，表明該醫(yī)療中心老年住院患者KPP感染的主要優(yōu)勢菌群比較單一，這一結(jié)果也強(qiáng)烈提示院內(nèi)感染是KPP感染的主要來源。在以后的研究中，將對同一地區(qū)內(nèi)的其他醫(yī)院同期分離KPP進(jìn)行MLVA分型，以確證這一結(jié)論。雖然不排除少量的輸入性感染(Ⅱ、Ⅲ群)，但需要明確的是，在住院過程中嚴(yán)格控制院內(nèi)感染的發(fā)生，對于避免KPP傳播、減少感染人數(shù)有著積極的作用。

[1]Podschun R，Ullmann U.Klebsiellaspp. as nosocomial pathogens： epidemiology，taxonomy，typing methods，and pathogenicity factors [J]. Clin Microbiol Rev，1998，11(4)：589- 603.

[2]Ko WC，Paterson DL，Sagnimeni AJ，et al. Community-acquiredKlebsiellapneumoniaebacteremia： global differences in clinical patterns [J]. Emerg Infect Dis，2002，8(2)：160- 166.

[3]Arlet G，Rouveau M，Casin I，et al. Molecular epidemiology ofKlebsiellapneumoniaestrains that produce SHV- 4 beta-lactamase and which were isolated in 14 French hospitals [J]. J Clin Microbiol，1994，32(10)：2553- 2558.

[4]Diancourt L，Passet V，Verhoef J，et al. Multilocus sequence typing ofKlebsiellapneumoniaenosocomial isolates [J]. J Clin Microbiol，2005，43(8)：4178- 4182.

[5]van Belkum A. Tracing isolates of bacterial species by multi locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) [J]. FEMS Immunol Med Microbiol，2007，49(1)：22- 27.

[6]Turton JF，Perry C，Elgohari S，et al. PCR characterization and typing ofKlebsiellapneumoniaeusing capsular type-specific，variable number tandem repeat and virulence gene targets [J]. J Med Microbiol，2010，59(Pt5)： 541- 547.

[7]Brink AA，von Wintersdorff CJ，van der Donk CF，et al. Development and validation of a single-tube multiple-locus variable number tandem repeat analysis forKlebsiellapneumonia[J]. PLoS One，2014，9(3)：e91209.

[8]李鐘響，金美琴，陳靈珊. 老年患者肺炎克雷伯菌感染及耐藥情況 [J]. 臨床和實(shí)驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，18(9)：1390- 1391.

[9]王慶，董海燕，包訓(xùn)迪，等. 安徽省391株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株MLVA基因分型研究 [J]. 中國防癆雜志，2013，35(1)：17- 19.

[10]Hawkey PM，Smith EG，Evans JT，et al.Mycobacterial interspersed repetitive unit typing ofMycolmcteriumtuberculosiscompared to IS6110-based restriction fragment length poly-morphism analysis for investigation of apparently clustered cases of tuberculosis [J]. J Clin Microbiol，2003，41(8)：3514- 3520.

Genotyping of Klebsiella Pneumonia Strains Isolated from Eldly Inpatients by Multiple-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis

ZHANG Yuan-yuan1，2，XU Ya-ping3，DU Peng-cheng1，2，QIANG Yu-jun1，ZHANG Wen1，CHEN Chen2，YU Ji-hong3，GUO Jun4，5

1State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control，National Institute for Communicable Disease Control and Prevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 102206，China

GUO JunTel：010- 66876432，E-mail： dragonet76@163.com

ObjectiveTo investigate the genotype ofklebsiellapneumoniastrains isolated from eldly inpatients by multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis. MethodsTotally 184klebsiellapneumoniastrains，isolated from eldly inpatients，were collected，and their genome DNA were extracted. The polymorphism of 7 variable-number tandem-repeat locus in the DNA samples was analyzed by multiple primers polymerase chain reaction and capillary electrophoresis. The clustering analysis of genotyping was carried out with the BioNumerics 5.1 software. ResultsA total of 139 genotypes were identified in 184klebsiellapneumoniaclinical strains，showing obvious genetic polymorphisms. With clustering analysis of genotypes，all the strains were categorized into three gene clusters (genogroups Ⅰ，Ⅱ，and Ⅲ). The genogroup Ⅰ was the biggest cluster，containing 93.06% of the isolated strains. ConclusionThere was a predominant cluster in theklebsiellapneumoniastrains isolated from eldly inpatients in our center，and the major source ofklebsiellapneumoniainfection remained the nosocomial infection.

eldly inpatients；infection；klebsiellapneumonia；multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis

中國博士后科學(xué)基金面上資助(2014M562610) Supported by China Postdoctoral Science Foundation (2014M562610) ;張媛媛和徐雅萍對本文貢獻(xiàn)相同 ZHANG Yuan-yuan and XU Ya-ping contributed equally to this article

郭軍電話：010- 66876432，電子郵件： dragonet76@163.com

R183.3

A

1000- 503X(2016)04- 0434- 04

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.04.012

2015- 09- 07)