胡穎智，沈海輝，鄔期望，沈宏，孫悅（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東廣州510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；.浙江大學(xué)微分析系統(tǒng)研究所，浙江杭州310058）

血根堿與c-myc G4-DNA相互作用的光譜法研究

胡穎智1，2，3，沈海輝1，2，3，鄔期望4，沈宏4，孫悅1，2，3
（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東廣州510006；3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；4.浙江大學(xué)微分析系統(tǒng)研究所，浙江杭州310058）

目的研究血根堿與c-myc G4-DNA的相互作用。方法采用紫外可見吸收光譜、圓二色譜、變溫試驗(yàn)等方法，對血根堿與c-myc G4-DNA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合比例、結(jié)合模式及穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果在紫外可見吸收光譜中，血根堿在300～350 nm之間的特征吸收峰隨c-myc G4-DNA濃度的增加出現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)和紅移，減色率ΔH=35.4%（Δλ=7 nm），與c-myc G4-DNA結(jié)合常數(shù)為3.1×104mol/L；G-四鏈體/血紅素過氧化物酶競爭試驗(yàn)中，血根堿競爭血紅素引起吸光度下降；變溫試驗(yàn)中c-myc G4-DNA的熔點(diǎn)在血根堿作用下升高4.7℃。結(jié)論血根堿以結(jié)合比例為1∶1外部堆積于c-myc G4-DNA，并促使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這可能是血根堿抗腫瘤的分子機(jī)制之一。

血根堿；c-myc G4-DNA；相互作用

四鏈螺旋結(jié)構(gòu)的核酸稱為 G-四鏈體（G-quadruplex），4個鳥嘌呤堿基通過Hoogsteen氫鍵配對形成G平面（G-tetrad），適當(dāng)體積的陽離子或配體可以促使多個G平面堆疊形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，能夠與G-四鏈體特異性結(jié)合并使之穩(wěn)定的化合物可通過降低原癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而達(dá)到抗腫瘤的效果［1］。c-myc是體內(nèi)重要的原癌基因之一，研究表明c-myc啟動區(qū)DNA形成的G-四鏈體已經(jīng)成為抗腫瘤藥物研究的靶點(diǎn)［2-4］。

血根堿（sanguinarine，San）是一種在白屈菜含量較高的生物堿，課題組前期試驗(yàn)［5］和許多體外試驗(yàn)證明，血根堿能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而抑制不同來源的癌細(xì)胞生長，包括肝癌、人鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌等癌細(xì)胞［6］。血根堿還是一種細(xì)胞周期的阻斷劑，是一種潛在的抗癌藥物［6］。JI Xiaohui等［7］研究表明血根堿可與C-myc22形成的G-四鏈體結(jié)合，誘導(dǎo)G-四鏈體的形成并提高其穩(wěn)定性，但缺乏深入研究。本文用G-四鏈體/血紅素過氧化物酶競爭試驗(yàn)結(jié)合光譜法進(jìn)一步探討了血根堿與c-myc G4-DNA的結(jié)合模式，并測得血根堿與c-myc G4-DNA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合比例，為以G-四鏈體為靶點(diǎn)的新型抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

K640型熱循環(huán)儀（杭州晶格科學(xué)儀器）；UV-2200PC型紫外-可見分光光度儀（上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司）；SC-15型數(shù)控恒溫槽（寧波新芝生物科技公司）；MOS-450圓二色譜儀器型號（法國BioLogic Science Instrument）。

c-myc G4-DNA為 C-myc22（5′-TGAGGGTGG GGAGGGTGGGGAA-3′）、HT4（5′-TTAGGGTTAGGG TTAGGGTTAGGG-3′）、Pu27（5′-TGGGGAGGGTGG GGAGGGTGGGGAAGG-3′）均購于英濰捷基上海貿(mào)易有限公司；血根堿（San，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，阿拉丁試劑公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、30%過氧化氫（H2O2）、血紅素（hemin）、二甲基亞砜（DMSO）、KCl（均為分析純，上海國藥集團(tuán)有限公司）。DNA用緩沖液（pH7.4，10 mmol/L Tris-Hcl）配制成100 μmol/L的儲備液，分裝后于-20℃儲存；hemin溶于DMSO，配制成500 μmol/L儲備液，儲存于-20℃；KCl溶液用緩沖液配置成500 μmol/L。DNA退火:DNA儲備液分別使用無K+和有K+緩沖液稀釋，置于熱循環(huán)儀95℃加熱10 min，緩慢冷卻至室溫形成DNA溶液。

1.2ABTS-H2O2顯色體系試驗(yàn)［8］

顯色試驗(yàn)樣品總體積為2.5 mL，向比色皿加入50 μmol/L DNA溶液100 μL，加入20 μmol/L hemin 250 μL，加入緩沖液2 100 μL，混合均勻后在恒溫槽37℃孵育1 h，向樣品中分別加入25 μL 40 mmol/L ABTS和H2O2。未加DNA為空白組，10 min時測定415 nm的吸光度。

1.3血根堿與C-myc22結(jié)合常數(shù)試驗(yàn)［9-10］

參比池加入緩沖液，樣品池中加入10 μmol/L血根堿溶液3 mL。每隔5 min用微量移液器分別往參比池和樣品池比色皿中加入2 μmol/L C-myc22溶液，使C-myc22與San濃度比值按一定比例遞增，在300～500 nm掃描吸收譜圖。

1.4血根堿與C-myc22結(jié)合比例試驗(yàn)［11］

保持San與C-myc22溶液總濃度10 μmol/L不變，改變體系中 San與 C-myc22的比例。測定327 nm的吸光度值，以相應(yīng)濃度的血根堿溶液作為空白對照，扣除空白后，以血根堿的含量作Job plot圖。數(shù)據(jù)用Origin 8軟件處理。

1.5血根堿與C-myc22結(jié)合模式試驗(yàn)［8］

G-四鏈體/Hemin過氧化物酶表征試驗(yàn)由紫外測定，向C-myc22溶液中加入hemin，37℃孵育1 h，即得具有過氧化物酶活性的DNA酶。再向溶液中加入San，使得溶液中hemin、C-myc22、K+和San成特定濃度比，37℃反應(yīng)1 h。在360～460 nm掃描紫外吸收光譜圖。

G-四鏈體/Hemin過氧化物酶競爭試驗(yàn)中樣品總體積2.5 mL，向比色皿加50 μmol/L C-myc22 G-四鏈體溶液50 μL，加入10 μmol/L hemin 250 μL，加入緩沖液1 900 μL，混合均勻后37℃孵育1 h，接著分別加入20 μmol/L和100 μmol/L San各250 μL，混合均勻后37℃孵育1 h，向樣品中分別加入40 mmol/L ABTS和40 mmol/L H2O2各25 μL。測定樣品在10 min內(nèi)415 nm處的吸光度變化。

1.6變溫試驗(yàn)

配制一定濃度的C-myc22溶液、含有血根堿的C-myc22溶液以及空白溶液，加入到帶有控溫裝置的石英比色池中（光程10 mm），經(jīng)過脫氣，塞上四氟乙烯以防止溶液在高溫蒸發(fā)。待吸光度穩(wěn)定后，以緩沖液或相同濃度的血根堿作參比，以0.25℃/min速度增溫，測定295 nm處、不同溫度下的吸光度。

1.7圓二色譜試驗(yàn)

C-myc22分別與一定比例的K+、hemin和 San混合均勻，37℃孵育1 h后，將樣品溶液加入到光徑1 cm的石英比色皿，從220 nm掃描至320 nm，掃描速率100 nm/min，帶寬10 nm，讀數(shù)3次，響應(yīng)時間1 s，測定光譜均扣除空白組。

2　結(jié)果與分析

2.1DNA鏈的選擇

血根堿與不同DNA鏈形成的G-四鏈體均有結(jié)合，如端粒鏈HT4［12］、啟動區(qū)Pu27［13］和C-myc22［7］，為找到對光譜法分析靈敏的鏈，采用ABTS-H2O2顯色體系對這3條DNA鏈與血紅素形成的G-四鏈體-hemin DNA酶催化活性進(jìn)行了比較，如圖1。可見，無K+情況下，這3條DNA與血紅素結(jié)合后都表現(xiàn)出微弱的催化活性，而有K+組中，DNA酶催化活性明顯提高，說明K+對G-四鏈體的形成至關(guān)重要。其中 C-myc22形成的 DNA酶催化活性最高，且C-myc22形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)單一，核磁譜圖清晰，結(jié)構(gòu)解析完全，因此在文獻(xiàn)［14］中以C-myc22為靶點(diǎn)，進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)與篩選。梅文杰課題組［10，15-16］也以C-myc22為抗腫瘤藥物靶點(diǎn)進(jìn)行研究。綜上所述，C-myc22形成的DNA酶催化活性高利于光譜法分析，且研究它與血根堿的相互作用可探討血根堿的抗腫瘤機(jī)制，所以選擇C-myc22鏈作為研究對象。

圖1　3種DNA酶催化活性的比較Figure 1 Comparison of three DNAzyme catalytic activity

2.2血根堿與C-myc22的結(jié)合常數(shù)

紫外-可見光譜法是研究G-四鏈體和化合物相互作用最常用的方法，通?；衔锱cDNA結(jié)合后最大吸收峰會有譜帶變化，以此來判斷化合物與DNA是否結(jié)合，從圖2可知血根堿加入C-myc22后發(fā)生了7 nm紅移（從327 nm至334 nm），并伴隨著35.4%的減色現(xiàn)象，通過下列方程計(jì)算出血根堿與C-myc22相互作用的結(jié)合常數(shù)Kb:

式中:DNA代表DNA的濃度；εa、εf、εb分別代表在不同 C-myc22濃度溶液中，游離的和與C-myc22鍵合飽和的血根堿的摩爾吸光系數(shù)；Kb可由擬合直線與y軸相交的截距求得，在試驗(yàn)條件下，計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)Kb為3.1×104mol/L，說明血根堿與C-myc22有較強(qiáng)的結(jié)合作用［8-9］。

圖2　血根堿與不同濃度C-myc22相互作用后的紫外吸收光譜圖Figure 2 Absorption spectra of San in the presence of increasing amounts of C-myc22

2.3血根堿與C-myc22的結(jié)合比例

Job plot分析試驗(yàn)即保持血根堿與G-四鏈體的總濃度不變，連續(xù)改變血根堿與G-四鏈體的濃度比，在不同的濃度比下的測定體系吸收信號，以此來確定 G-四鏈體與血根堿結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比［8，11］。從圖3可見，隨著體系中血根堿比例的增加，吸光度減少程度先變大后變小，交叉點(diǎn)是0.5，表明血根堿與C-myc22的結(jié)合比為1∶1。

圖3　血根堿與C-myc22相互作用的Job plotFigure 3 The Job plot of San with C-myc22

2.4 血根堿與C-myc22的結(jié)合模式

血紅素卟啉環(huán)在400 nm波長附近有紫外吸收，即Soret帶，當(dāng)血紅素與G-四鏈體結(jié)合形成DNA酶后，Soret帶會產(chǎn)生增色紅移現(xiàn)象，可表征G-四鏈體/ Hemin過氧化物酶。如圖4所示，血紅素的特征吸收波長為397 nm（曲線a），當(dāng)血紅素與C-myc22作用后，Soret帶有紅移（7 nm）及增色現(xiàn)象（曲線b），這與文獻(xiàn)［17］報(bào)道的血紅素與G-四鏈體親合作用結(jié)果一致，說明C-myc22在無K+的情況下也能形成G-四鏈體；在有K+組中，血紅素與C-myc22反應(yīng)的紅移及增色比無K+組明顯增強(qiáng)（曲線c），說明K+能大量促進(jìn)C-myc22形成G-四鏈體，加入血根堿后紅移增色現(xiàn)象減弱（曲線d），表明血根堿競爭血紅素與G-四鏈體的結(jié)合。

圖4　血紅素、C-myc22和San紫外可見吸收光譜Figure 4 UV-visible absorption spectra of San/C-myc22/ hemin complex

Hemin通過外部堆積的方式與G-四鏈體結(jié)合，G-四鏈體/hemin復(fù)合物可催化H2O2氧化ABTS2-。其他分子如能與 G-四鏈體結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)與hemin相同，則能與 hemin競爭，使得 G-四鏈體/ hemin復(fù)合物減少，導(dǎo)致體系的顏色變淺，吸光度下降［8］，因此可用G-四鏈體/hemin過氧化物酶競爭試驗(yàn)判斷結(jié)合模式。由圖4可見，血根堿能與hemin發(fā)生競爭關(guān)系。C-myc22和血紅素體系中加入不同濃度血根堿，血根堿濃度越高，體系催化活性也越低（見圖5），說明San與hemin有競爭作用，降低了G-四鏈體/hemin過氧化物的酶活性。

從上述紫外光譜試驗(yàn)和DNA酶催化H2O2氧化ABTS2-試驗(yàn)結(jié)果均可推斷:在與G-四鏈體的結(jié)合中，San與hemin是競爭關(guān)系，hemin是通過外部堆積的方式與G-四鏈體結(jié)合，因此推斷血根堿與G-四鏈體的結(jié)合模式也為外部堆積。

2.5變溫試驗(yàn)

變溫試驗(yàn)檢測G-四鏈體通常是測定295 nm吸收，可以得到G-四鏈體結(jié)構(gòu)存在與否以及化合物能否穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)［11］。從圖6中可見，隨著溫度的升高，295 nm熔融曲線都形成倒“S”曲線，說明均有G-四鏈體存在；無 K+組，C-myc22的 Tm值為31.5℃；有K+組，熔點(diǎn)Tm為74.8℃，明顯增大，是K+進(jìn)入G-四鏈體平面中間，促進(jìn)了G-四鏈體的穩(wěn)定性［18］；有K+組加入San后，Tm為79.5℃，額外增加了4.7℃，說明San與C-myc22結(jié)合并增加其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

圖5　血根堿抑制G-四鏈體-hemin DNA酶催化活性Figure 5 Inhibition effect of San on activity of G-quadruplexhemin DNAzyme

圖6　C-myc22與K+、San的變溫試驗(yàn)圖譜Figure 6 The melting temperature experiment of C-myc22 with K+and San

2.6圓二色譜表征G-四鏈體

CD是研究G-四鏈體構(gòu)型和G-四鏈體與化合物相互作用的重要方法之一，平行型和反平行型G-四鏈體各自具備不同的CD特征譜圖，平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)265 nm正峰和240 nm負(fù)峰［10］。從圖7可知，C-myc22無K+能自身形成平行G-四鏈體（曲線a）；當(dāng)加入10 mmol/L K+時，240 nm負(fù)峰明顯降低，265 nm正峰增高（曲線b），說明K+促進(jìn)C-myc22形成平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)；hemin和San加入后，CD譜圖均沒有變化（曲線c和d基本相同），而有K+組，San能促進(jìn)C-myc22形成G-四鏈體［7］。以上說明San對G-四鏈體結(jié)構(gòu)沒有破壞或誘導(dǎo)構(gòu)型轉(zhuǎn)變作用，并且與K+進(jìn)入G-四鏈體平面之間不同，有可能與hemin一致，以外部堆積形式與G-四鏈體結(jié)合。

圖7　C-myc22與K+、hemin、San相互作用CD譜圖Figure 7 CD spectra of interaction between K+，hemin，San and C-myc22

3　結(jié)論

本文研究了血根堿與C-myc22的相互作用，K+進(jìn)入相鄰的G-四鏈體平面中間，促進(jìn)C-myc22形成G-四鏈體，紫外分光光度法測得血根堿與C-myc22結(jié)合常數(shù)為3.1×104mol/L，結(jié)合比例為1∶1。采用G-四鏈體/hemin過氧化物酶競爭試驗(yàn)和紫外光譜法證明血根堿與G-四鏈體結(jié)合模式為外部堆積，變溫試驗(yàn)表明K+和血根堿促進(jìn)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，圓二色譜中血根堿沒有使G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，佐證了血根堿與G-四鏈體結(jié)合模式為外部堆積。血根堿抗腫瘤作用可能與c-myc密切相關(guān)，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。

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（責(zé)任編輯：陳翔）

Study on the interaction between c-myc G4-DNA and sanguinarine by spectrometry

HU Yingzhi1，2，3，SHEN Haihui1，2，3，WU Qiwang4，SHEN Hong4，SUN Yue1，2，3
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University；2.Key Laboratory of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM，China；3.Engineering Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province，Guangzhou，510006；4.Institute of Microanalytical Systems，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

Objective To study the interaction between sanguinarine and c-myc G4-DNA.Methods The binding constants，binding modes，binding ratio and stabilization of sanguinarine with c-myc G4-DNA were studied by UV-Vis spectroscopy，circular dichroism，and melting temperature experiment method.Results In UV-Vis spectroscopy，it was found that there was a hypochromise of 35.4%（Δλ=7 nm）at the characterized absorption of sanguinarine in the presence of c-myc G4-DNA，and the binding constants value was 3.1×104mol/L.In G-quadruplex/hemin peroxidase competition experiment，sanguinarine competed with the hemin to bind with G-quadruplex，which led to a decrease of absorbance.The melting point of cmyc G4 DNA was increased about ΔTm=4.7℃ in melting temperature experiment.Conclusion sanguinarine can increase the stability of c-myc G4-DNA，and bind with c-myc G4-DNA at a ratio of 1:1 by external stacking，which may be one of the antitumor mechanisms of sanguinarine.

sanguinarine；c-myc G4-DNA；interaction

R914

A

1006-8783（2016）04-0431-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016051706

2016-05-17

國家自然科學(xué)基金（81001600）；浙江省自然科學(xué)基金（LY16B050004）

胡穎智（1991—），女，2014級碩士研究生，從事微流控分析與中藥分析研究，Email:hyztournesol@sina.com；通信作者:孫悅（1977—），女，博士，教授，從事微流控分析與中藥分析研究，Email:sunyuesdzb@163.com；沈宏，男，博士，副教授，主要從事分析化學(xué)研究，Email:shzju@zju.edu.cn。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-07-011 14:56 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1456.006.html