陳艷琳，王穎芳（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

白花蛇舌草總RNA提取方法比較與優(yōu)化

陳艷琳，王穎芳
（廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州510006）

目的探索白花蛇舌草總RNA最佳提取方法。方法以廣東產白花蛇舌草為材料，選用Trizol法、多糖多酚總RNA提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物總RNA提取試劑盒、改良CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和葉總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳及Aligent 2100檢測，比較5種提取方法所得總RNA的完整性、純度及產率。結果RNA prep Pure Plant Kit及植物總RNA提取試劑盒均能提取到總RNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S條帶清晰，前者亮度高于后者。RNA prep Pure Plant Kit中D（γ）260 nm/D（γ）280 nm和D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值均在2.0左右，葉片組織RNA質量濃度為390.35 mg/L，經Aligent 2100檢測，28S條帶亮度是18S的2倍。改良CTAB法所得RNA 28S和18S條帶穩(wěn)定清晰，但受基因組污染嚴重。RNAiso Plus和Trizol法無法完成蛇舌草總RNA的提取。結論 不同植物、不同品種或同一植物不同部位皆存在屬性差異，要根據植物特性選擇合適的RNA提取方法。RNA prep Pure Plant Kit提取蛇舌草根、葉片RNA效果較優(yōu)，可滿足后續(xù)試驗要求。

白花蛇舌草；總RNA；提取方法

白花蛇舌草最早載于《廣西中藥志》，來源于茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.，以干燥全草入藥［1］，別名蛇舌草、蛇刺草、羊須草等。本品性寒，味苦、甘，具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛之功效，臨床應用廣泛。現代藥理研究揭示白花蛇舌草具有抗菌消炎、抗腫瘤作用［2-3］。2015年版《中國藥典》只收載了白花蛇舌草的復方制劑，其原料藥材未收載在內［4］，《廣西中藥志》等地方藥材標準僅簡要介紹白花蛇舌草的理化鑒別及藥理作用。

隨著植物靶mRNA表達調控、small RNA差異表達及miRNAs等研究的進展，對白花蛇舌草抗感染、抗腫瘤的研究已從傳統(tǒng)的藥用活性成分［5］、藥理機制等層面，向微觀調控表達方面轉化。制備質量高、完整性佳的RNA是進行RT-PCR、small RNA測序、靶基因預測等分子生物學研究的首要條件。蛇舌草富含多糖［6］及次生代謝產物，RNA的分離純化易受干擾，從而影響RNA提取的質量和產量。本研究以蛇舌草根、葉片為材料，分別選用Trizol法、多糖多酚總RNA提取試劑盒（RNA prep Pure Plant Kit）、植物總 RNA提取試劑盒、改良 CTAB法、RNAiso Plus法提取蛇舌草根和葉組織RNA，再經瓊脂糖凝膠電泳、Aligent 2100及TGem微量分光光度計檢測，以選擇適合白花蛇舌草組織總RNA的提取方法。

1　材料與儀器

1.1藥材

樣品于2015年9月采集于廣東藥科大學藥用植物園，由中藥學院劉基柱副教授鑒定為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的全草。

將整株白花蛇舌草用純化水洗凈，置70%（體積分數，下同）乙醇中消毒1 min，滅菌水沖洗干凈，消毒紗布擦干水分，用刀將根部切成小段，放入凍存管經液氮速凍，于-80℃保存。葉片進行同樣的處理并保存。每次選取所需部位約100 mg備用。

1.2試劑

RNAiso Plus試劑（TaKaRa生物公司）；RNA prep Pure Plant Kit（北京天根生物公司）；植物總RNA提取試劑盒（北京天根生物公司）；CTAB（深圳基迪奧生物公司）；β-巰基乙醇（廣州鼎國生物公司）；酚仿試劑（廣州鼎國生物公司）；三氯甲烷、異戊醇等生化試劑及瓊脂糖凝膠電泳試劑均購自上海生工生物公司。

1.3儀器

3-30K型號超低溫離心機（德國Sigma）；Gene Genius型全自動凝膠成像及分析系統(tǒng)（美國Syngene公司）；BG-SUBMIDI型電泳槽（百晶儀器廠）；Aligent 2100（美國安捷倫公司）；TGem微量分光光度計（北京天根生物公司）。

2　方法

2.1總RNA提取

2.1.1改良 CTAB法［7］研缽用液氮預冷，從-80℃冰箱取蛇舌草根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉。將粉末轉移至1.5 mL RNase free離心管中，加入CTAB 600 μL（臨用時加入質量分數1% β-巰基乙醇12 μL），混勻，65℃水浴20 min（期間振搖幾次）。加入等體積三氯甲烷-異戊醇（體積比24 ∶1），混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，加等體積的酚仿試劑（苯酚-三氯甲烷，體積比25 ∶24）混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取上層水相，加入等體積的三氯甲烷-異戊醇（體積比24∶1）混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積異丙醇，于-20℃沉淀1 h，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗滌沉淀，重復1次，4℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，4℃、8 500 r/min離心15 s，盡可能吸干乙醇，真空干燥2～4 min。加入DEPC水20～50 μL，室溫溶解，-80℃保存。

2.1.2Trizol法［8］研缽用液氮預冷，從-80℃冰箱取蛇舌草的根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉，將粉末轉移至裝有1 mL Trizol Reagent的RNase free離心管中，混勻，冰上靜置5 min。加200 μL三氯甲烷（Trizol試劑的1/5），劇烈振蕩至溶液呈乳白色，冰上放置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，冰上放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min。棄上清，加入75%乙醇（DEPC水配制）1 mL，洗滌RNA，4℃、12 000 r/min離心10 min。吸盡乙醇，倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.3RNAiso Plus法［9］研缽用液氮預冷，從-80℃冰箱取蛇舌草的根、葉各約100 mg，加液氮迅速研磨成粉，加適量的RNAiso Plus后勻漿，轉移至1 mL RNase free離心管中，混勻，室溫放置5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至1.5 mL RNase free離心管，加1/5 RNAiso Plus的三氯甲烷，劇烈振蕩至溶液呈現乳白色，室溫靜置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上清液，加等體積的異丙醇，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清。用等量的75%乙醇（DEPC水配制）洗滌RNA，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清。倒置EP管，干燥RNA，加入DEPC水20～40 μL使溶解，-80℃保存。

2.1.4RNA prep Pure Plant Kit試劑盒 RNA prep Pure Plant Kit試劑盒參照具體的說明書進行。

2.1.5植物總RNA提取試劑盒法 植物總RNA提取試劑盒參照相應的說明書進行。

2.2不同提取方法總RNA質量檢測

2.2.1總RNA完整性檢測 取總RNA樣品3 μL，質量分數1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，150 V恒壓15 min，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察RNA條帶，并拍照記錄。

2.2.2總RNA純度檢測 取總RNA樣品8 μL，進行TGem微量分光光度檢測，每次上樣1.5 μL，平行測5次，記錄總 RNA濃度、D（γ）260 nm/D（γ）280 nm、D（γ）260 nm/D（γ）230 nm，求平均值，并計算RSD值。

2.2.3Agilent 2100 Bioanalyzer檢測 將RNA prep Pure Plant Kit試劑盒、CTAB法提取所得總RNA樣品分離純化后，Agilent 2100 Bioanalyzer上樣檢測總RNA質量完整性，并構建總RNA表達譜。

3　結果與分析

3.1瓊脂糖凝膠電泳總RNA完整性檢測

將不同提取方法所得RNA進行電泳檢測，結果見圖1?？梢?，RNA prep Pure Plant Kit提取總RNA 的28S、18S條帶清晰穩(wěn)定，此方法幾乎消除了DNA、蛋白質的污染，說明此種方法所得蛇舌草根、葉片總RNA的質量、完整性較佳。植物總RNA提取試劑盒提取得到的RNA條帶雖然穩(wěn)定，但2條主條帶亮度幾乎相等，說明RNA存在部分降解，且產率低于RNA prep Pure Plant Kit。改良CTAB法提取蛇舌草根、葉片總RNA的28S、18S條帶雖完整，可見葉片組織RNA 28S條帶亮度約18S的2倍；但點樣孔與28S之間出現明亮條帶，說明RNA受雜質污染；且出現拖尾現象，說明 RNA存在降解。RNAiso Plus法及Trizol試劑提取RNA結果不理想。

圖1　5種方法提取的蛇舌草根和葉片總RNA瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 1 The results of five total RNA extraction methods by agarose gel electrophoresis（AGE）

3.2總RNA純度檢測

據文獻［10］報道，當D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值在1.8～2.1，說明提取的RNA不受蛋白質或多糖雜質污染，純度高、質量佳；當D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值低于或高于2.0～2.3，說明RNA可能受降解、蛋白質的干擾。

將上述不同方法提取到的蛇舌草根和葉總RNA在TGem微量分光光度計上檢測，RNA純度檢測結果見表1?？梢?，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取的根、葉片總 RNA的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm值分別為1.928、2.019，處于1.8～2.1范圍內，說明無蛋白質或多糖污染，D（γ）260 nm/D（γ）230 nm值分別為1.94、1.937，接近2.0，說明提取的RNA純度較高、無降解。雖然改良CTAB法提取的根、葉片總RNA的濃度和RNA prep Pure Plant Kit試劑盒相差無幾，但前者的 D（γ）260 nm/D（γ）280 nm比值明顯＜1.8，說明所得RNA中存在蛋白質或有機溶劑的污染。在葉片 RNA 中 D（γ）260 nm/D（γ）230 nm比值＞2.3，則RNA降解，這與瓊脂糖凝膠電泳結果相符。

表1　5種方法提取的蛇舌草根、葉片總RNA檢測結果Table 1 The production rate and quality of five total RNA extraction methods

為進一步比較分析RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取RNA的質量，篩選更適合蛇舌草總RNA提取的方法，將RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取得到的蛇舌草根、葉總RNA混合純化，進行Agilent 2100質量檢測，質檢表達譜見圖2?？梢?，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒表達譜顯示2條清晰完整的主峰，分別為28S和18S；改良CTAB提取RNA的表達譜可見多條不規(guī)則峰帶，無特征性的主峰。其余檢測結果數據見表2?？梢?，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒所得RNA符合建庫標準，而改良CTAB法所得RNA降解、含有雜質較多，不符合建庫標準。

3.3Agilent 2100質檢

Agilent 2100生物分析儀可以微小樣品消耗量進行檢測，最大限度地減少有害物質的接觸，降低RNA酶污染。其采用的RIN值能夠直觀地反映總RNA降解程度，即使是微量的降解也很容易被檢測出來，使結果標準化，是目前最好的RNA質量分析方法。

圖2　RNA prep Pure Plant Kit試劑盒（A）和改良CTAB法（B）提取蛇舌草總RNA Agligent 2100檢測結果Figure 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit（A）and Improved CTAB method（B）　to the extraction of Hedyotis diffusa Willd total RNA by Aligent 2000

表2　RNA prep Pure Plant Kit試劑盒和改良CTAB法提取蛇舌草總RNA質量檢測結果Table 2 The results of RNA prep Pure Plant Kit and improved CTAB method to the extraction of Hedyotis diffusa Willd RNA

4　討論

Trizol法、CTAB法及改良的CTAB法、酚-SDS法、試劑盒法等都是最常見的RNA提取方法。陳美霞等［11］通過多種植物RNA提取方法的對比與優(yōu)化，發(fā)現用熱硼酸法能高效快速的提取到紅麻福紅992葉片總RNA。因為不同植物或者同一植物不同部位及不同品種往往存在屬性差異，材料內組分含量及質量也有差異，在研究中無法用固定的方法來提取不同植物、不同組織的RNA，需結合材料特性，不斷探索與優(yōu)化，找到合適的提取方法。

蛇舌草成熟期很短，植物纖維、多糖等含量較高，生長過程中次生產物大量積累［5］。多糖的結構與RNA相似度高，對RNA的分離純化有很大影響，在RNA沉淀過程中，多糖雜質易形成凝膠狀沉淀，在DEPC溶解后這部分沉淀易形成多糖絮狀物，可造成RNA產率降低，因此，能否將這些雜質去除是提取高質量RNA的關鍵［12］。蛋白質污染也是影響RNA質量的主要因素之一［13］，試驗中在蛋白質沉淀環(huán)節(jié)上清液能夠少吸盡量不要多吸。

RNase是另一個影響RNA質量的主要物質，本身性質非常穩(wěn)定，分布廣泛，對RNA有水解作用，但對DNA不起作用，這給試驗增添了難度［14］。在研磨破碎成粉的過程中，除內源RNase會造成RNA的降解外［15］，操作者汗液及唾液、空氣灰塵、各種試驗器皿中均可能存在RNA酶。為減少RNase酶污染，首先，試驗所用離心管須無菌無酶，所用耗材、試劑等做滅RNase處理，即DEPC水浸泡過夜或高壓滅菌等；其次，RNA提取最好在無菌超凈臺進行，且操作者須全程戴口罩、勤換手套。

本文結果顯示，RNA prep Pure Plant Kit試劑盒對白花蛇舌草的植物細胞壁具有較強的裂解能力，試劑盒中DNAse I干粉可有效地消除基因組污染，穩(wěn)定性好，無異丙醇及乙醇洗滌過程，RNA可以直接從離心柱上洗脫，避免了其他方法干燥不易溶解的問題，因此RNA產率相對較高。本方法可基本上排除多糖、蛋白質及DNA的干擾，經瓊脂糖凝膠電泳及Aligent 2100生物分析儀檢測分析，提取的總RNA質量和純度均可滿足后續(xù)small RNA測序、靶mRNA預測、轉錄組測序等分子生物學實驗要求。

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（責任編輯：陳翔）

本刊將更名為《廣東藥科大學學報》

廣東藥學院已更名為廣東藥科大學，本刊也將隨之更名。但期刊更名需上報國家新聞出版廣電總局審批，批準后才能啟用新刊名?，F更名事項正在申辦中，因此，目前本刊仍用《廣東藥學院學報》刊名出版，但本校論文的作者單位改為“廣東藥科大學”。

（本刊編輯部）

Comparison and optimization of the total RNA extraction method from Hedyotis diffusa Willd

CHEN Yanlin，WANG Yingfang
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the best extraction method of total RNA in Hedyotis diffusa Willd.Methods Taking roots and leaves of Guangdong-grown Hedyotis diffusa Willd.as materials，Trizol method，RNA prep Pure Plant Kit，Plant Total RNA extraction kit，Improved CTAB method and RNAiso Plus Reagent method were used to extract total RNA，and the integrity，purity and yield of five total RNA extraction methods were compared by agarose gel electrophoresis（AGE）and Aligent 2100.Results RNA prep Pure Plant Kit and Plant Total RNA extraction kit could extract the integral and high-quality total RNA.According the 1.5% agarose gel electrophoresis（AGE）experiment，both the 28S and 18S bands were clear，and the former was brighter than the latter.D（γ）260 nm/D（γ）280 nmand D（γ）260 nm/D（γ）230 nmwere all in 2.0 above，and the leaves production rate was the highest and up to 390.35 g/L.The result of Aligent 2100 showed that the 28S band was twice the brightness as the 18S.Although the improved CTAB method could effectively suppress the influence of polysaccharides and polyphenols，the genome were polluted seriously.Both RNAiso Plus reagent method and Trizol were useless for the extraction of total RNA.Conclusion The difference lies in different species of plants or different varieties of one species，and it even occurs indifferent parts of the same plant，so the RNA extraction method must be selected appropriately according to the characteristics of plants.RNA prep Pure Plant Kit has been proved to be able to extract good-quality RNA from the roots and leaves of Hedyotis diffusa Willd.tissue，which can meet the requirements of subsequent experiment.

Hedyotis diffusa Willd；Total RNA；extraction

R282.2

A

1006-8783（2016）04-0410-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032402

2016-03-24

國家自然科學基金青年基金項目（81403195）；廣東省自然科學基金項目（S2013010015418）

陳艷琳（1991—），女，2014級碩士研究生，Email:944589543@qq.com；通信作者:王穎芳（1975—），女，副教授，從事中藥方劑學研究，Email:150306757@qq.com。

網絡出版時間:2016-07-08 17:09 網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160708.1709.005.html