林勤，徐文雅，董斌，陳艷芬，趙越（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

響應(yīng)面法優(yōu)化類球紅細(xì)菌中輔酶Q10超聲提取工藝

林勤，徐文雅，董斌，陳艷芬，趙越
（廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的優(yōu)選類球紅細(xì)菌中輔酶Q10的最佳超聲提取工藝。方法采用HPLC法測(cè)定輔酶Q10質(zhì)量濃度，以菌體中輔酶Q10的質(zhì)量濃度作為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲波輸出功率、超聲波每次提取時(shí)間和超聲波每次輻射時(shí)間這3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果類球紅細(xì)菌中輔酶Q10的最佳超聲提取工藝條件為:超聲波輸出功率為250 W，超聲波每次提取時(shí)間為10 min，超聲波每次輻射時(shí)間為8 s。在該條件下，輔酶Q10質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為11.535 1 μg/mL，實(shí)測(cè)平均值為11.451 8 μg/mL。結(jié)論本文所得工藝方法切實(shí)可行，為類球紅細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10的進(jìn)一步研究提供參考。

類球紅細(xì)菌；輔酶Q10；提取工藝；響應(yīng)面法

輔酶Q10廣泛存在于自然界，是細(xì)胞呼吸鏈上的一種遞氫體［1］。輔酶 Q10具有長(zhǎng)的異戊二烯側(cè)鏈，易溶于正己烷、三氯甲烷、苯、四氯化碳，溶于丙酮、石油醚及乙醚，微溶于乙醇，不溶于水和甲醇，在光照下易分解呈微紅色，對(duì)溫度和濕度較穩(wěn)定［2］。輔酶Q10具有治療充血性心力衰竭［3］、降壓［4］、抗腫瘤、保護(hù)心血管等功效，還作為抗氧化劑用于化妝品中以延緩皮膚衰老［5-7］。

目前，輔酶Q10的提取制備普遍采用醇?jí)A皂化法和有機(jī)溶劑萃取法［8］，但這些傳統(tǒng)提取方法對(duì)于輔酶Q10的損失較大。輔酶Q10在生物體內(nèi)通過醌環(huán)亞層電子的范德華力相連［9］，超聲波破碎法提取類球紅細(xì)菌菌體的輔酶Q10，是利用聲波高加速度、加速介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)和空化效應(yīng)，可提高目標(biāo)物從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率，促進(jìn)目的產(chǎn)物進(jìn)入溶劑。

本文參考李德和等［10］采用HPLC法測(cè)定類球紅細(xì)菌中輔酶Q10質(zhì)量濃度的方法，以丙酮作為提取溶劑，超聲破碎輔助提取輔酶Q10，并進(jìn)一步采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［11-13］優(yōu)化超聲提取工藝。在優(yōu)化過程中，以輔酶Q10質(zhì)量濃度為指標(biāo)響應(yīng)值，選取超聲波輸出功率、超聲波每次提取時(shí)間和超聲波每次輻射時(shí)間這3個(gè)影響因素用于考察輔酶Q10的最佳提取工藝，克服了正交試驗(yàn)只能對(duì)孤立點(diǎn)進(jìn)行分析而不能給出直觀圖形的缺點(diǎn)，為類球紅細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10提供參考［14］。

1　儀器與材料

BP-211D 211D電子天平（德國Sartorius公司）；AY-120電子天平（日本Shimadzu公司）；3-30KS離心機(jī)（德國Sigma公司）；SCIENTZ-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝超聲儀器有限公司）；RV10 basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKAIKA公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DLSO-5/20低溫冷卻循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；UV-2450紫外-可見分光度計(jì)（日本島津公司）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司）；DIKMA platisil ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱（天津迪馬公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國Stik公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；RXZ人工氣候箱（寧波江南儀器廠）。

類球紅細(xì)菌（編號(hào):1.2174，中國科學(xué)院微生物研究所）；輔酶Q10對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院）；無水乙醇（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，瑞典Oceanpak公司）；水為屈臣氏蒸餾水；酵母膏為國產(chǎn)生物純；其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1HPLC法測(cè)定類球紅細(xì)菌中輔酶 Q10質(zhì)量濃度［10］

2.1.1色譜條件 色譜柱:DIKMA Platisil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相:甲醇-無水乙醇（體積比20∶80），檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm，柱溫:35℃，進(jìn)樣體積:10 μL，流速:1 mL/min。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取輔酶Q10對(duì)照品1.6 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻得到32.0 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取0.5、1、3、5、7、10 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻分別得到1.6、3.2、9.6、16、22.4、32.0 μg/mL的對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL，以峰面積（A）對(duì)質(zhì)量濃度（ρ）作線性回歸，得回歸方程A=4 240.3ρ+172 01，R2=0.999 7（n=6），表明輔酶Q10質(zhì)量濃度在1.6～32.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.3供試品溶液的制備

2.1.3.1 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 培養(yǎng)基配方:無水乙酸鈉3.0 g，（NH4）2SO41.0 g，酵母膏2.0 g，CaCl20.05 g，MgSO40.2 g，K2HPO41.0 g，KH2PO40.7 g，微量元素液4 mL，維生素液1 mL，純化水1 000 mL。類球紅細(xì)菌培養(yǎng)液的配制:配制1 000 mL培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，接入對(duì)數(shù)期菌種，于實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中培養(yǎng)6 d，即得。

2.1.3.2 類球紅細(xì)菌中輔酶Q10的提取［10］取類球紅細(xì)菌培養(yǎng)液50 mL，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，獲得的菌體用生理鹽水洗滌2次，以此獲得濕菌體，然后加入丙酮10 mL充分混勻，避光超聲破碎輔助提取10 min，3 000 r/min離心收集上清液，殘?jiān)貜?fù)2次，合并3次上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加無水乙醇定容至10 mL。

2.1.4專屬性考察［15］選用“2.1.2”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為16 μg/mL的輔酶Q10對(duì)照品溶液及“2.1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析。結(jié)果，輔酶Q10與相鄰峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按輔酶Q10計(jì)不小于5 000。色譜圖見圖1。

圖1　輔酶Q10對(duì)照品（A）和樣品（B）的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC Chromatograms of CoQ10control（A）and samples（B）

2.1.5 方法學(xué)考察 取“2.1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得輔酶Q10的峰面積RSD為1.13%，表明儀器精密度良好。然后，再分別于2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，在相同條件下測(cè)得輔酶Q10峰面積RSD為0.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。取同一批類球紅細(xì)菌輔酶Q10提取液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得平均質(zhì)量濃度為3.466 μg/mL，RSD為0.62%。加樣回收率試驗(yàn)測(cè)得輔酶Q10平均回收率為99.18%，RSD為3.41%，表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.2響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲波輸出功率、每次提取時(shí)間和每次輻射時(shí)間為考察因素，以輔酶Q10質(zhì)量濃度為響應(yīng)值（Y），采用Design-Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，共有17個(gè)試驗(yàn)，其中12個(gè)為析因試驗(yàn)，另外5個(gè)為中心試驗(yàn)，用于估算誤差，見表1～表2。

表1　響應(yīng)面法試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface

2.3建立模型及顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6響應(yīng)面軟件，對(duì)表2中17個(gè)輔酶Q10質(zhì)量濃度的數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程Y=-11.968 41+2.675 94X1+ 0.021 312 X2+0.623 89X3-0.003 127 5X1X2-0.091 146X1X3+0.006 7487 5X2X3-0.059 218X1

2-0.000 022 885X22-0.072 053，然后進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3?？梢?，模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.001），即各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系非常顯著，失擬項(xiàng)也顯著（P＜0.05）；相關(guān)系數(shù)R2=0.961 4，校正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.911 7，說明數(shù)據(jù)具有一定可靠性；信噪比16.780＞4，可知回歸方程的擬合度和可信度均較高。綜上所述，該回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 　Design scheme and results of response surface experiment

表3　模型方差分析Table 3 ANOVA of model

2.4響應(yīng)曲面的分析

采用Design-EXpert 8.0.6響應(yīng)面軟件，分析超聲波每次提取時(shí)間、超聲波輸出功率和超聲波每次輻射時(shí)間之間的交互作用對(duì)輔酶Q10質(zhì)量濃度的影響，分別得到相互因素的二次多項(xiàng)回歸方程:當(dāng)去掉回歸系數(shù)X3時(shí)，Y=-11.425 76+2.169 52X1+0.064 231X2-0.003 127 5X1X2-0.060-0.000 028 952；當(dāng)去掉回歸系數(shù) X1時(shí)，Y=+ 10.689 82-0.011 730X2-0.385 71X3+0.006 748 75X2X3-0.000 034 105-0.079 066；當(dāng)去掉回歸系數(shù)X2時(shí)，Y=-8.720 88+2.058 47X1+1.982 67X3-0.091 146X1X3-0.059-0.072 806。根據(jù)以上方程繪制響應(yīng)曲面圖見圖2。可見，以上3種因素對(duì)輔酶Q10質(zhì)量濃度的影響次序?yàn)槌暡ㄝ敵龉β剩╔2）＞超聲波每次提取時(shí)間（X1）＞超聲波每次輻射時(shí)間（X3），這與表3的方差分析結(jié)果相符。

圖2　各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖Figure 2 Response surface analysis of the interaction of each factor

2.5輔酶Q10最佳提取工藝

利用Design-expert 8.0.6模擬得出的類球紅細(xì)菌中輔酶Q10最優(yōu)提取工藝為超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時(shí)間9.84 min和超聲波每次輻射時(shí)間 8 s。所得輔酶 Q10質(zhì)量濃度的預(yù)測(cè)值為11.535 1 μg/mL。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法結(jié)果的可靠性，從實(shí)際生產(chǎn)出發(fā)，設(shè)定超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時(shí)間10 min和超聲波每次輻射時(shí)間8 s，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的輔酶Q10質(zhì)量濃度實(shí)際平均值為11.451 8 μg/mL，RSD為0.896%。實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相比誤差僅為0.724 8%，相差較小，說明模型是可行的，響應(yīng)面法優(yōu)化得到的輔酶Q10提取工藝具有實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。

3　討論

本試驗(yàn)前期選取了超聲波輸出功率（100、150、200、250、300 W）、超聲波每次提取時(shí)間（6、9、12、15、18 min）和超聲波每次輻射時(shí)間（2、4、6、8、9.9 s）這3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，各因素的最佳范圍為:超聲波輸出功率150～250 W，超聲波每次提取時(shí)間9～15 min，超聲波每次輻射時(shí)間4～8 s。使用響應(yīng)曲面法建立數(shù)學(xué)模型，利用模型的響應(yīng)曲面圖得到優(yōu)化的工藝條件為:超聲波輸出功率250 W、超聲波每次提取時(shí)間9.84 min和超聲波每次輻射時(shí)間8 s，在此條件下，輔酶Q10質(zhì)量濃度的理論值為11.535 1 μg/mL，均高于工藝優(yōu)化前（8.712 60 μg/mL）及文獻(xiàn)［10］報(bào)道的5.914 μg/mL。

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲波輸出功率與超聲波每次提取時(shí)間顯著影響輔酶Q10的提取率，經(jīng)二次多項(xiàng)回歸模型，得到了最佳提取工藝，且實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值吻合，說明了Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有良好的可行性，并且響應(yīng)面法能較好地對(duì)類球紅細(xì)菌中輔酶Q10的超聲提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，也為利用類球紅細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化斑蝥獲得抗氧化效果更顯著的保健品研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳翔）

Optimization of extraction conditions for coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology

LIN Qin，XU Wenya，DONG Bin，CHEN Yanfen，ZHAO Yue
（School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the extraction conditions of coenzyme Q10from Rhodobacter sphaeroides by surface response methodology.Methods The concentration of coenzyme Q10was set as response value，based on single factor experiments，and the response surface methodology was used to study the effects of ultrasonic power，ultrasonic extraction time at a time and ultrasonic radiation time at a time on the extraction rate of coenzyme Q10.The content of coenzyme Q10was determined by HPLC.Results The optimal extraction conditions were as follows:ultrasonic power 250 W，ultrasonic extraction time at a time 10 min and ultrasonic radiation time at a time 8 s，under these conditions，the prediction value of coenzyme Q10was 11.535 1 μg/mL and the measured value was 11.451 8 μg/mL.Conclusion The experimental process is feasible，which can provide technical reference for the further research of coenzyme Q10in Rhodobacter sphaeroides.

Rhodobacter sphaeroides；coenzyme Q10；extraction；surface response methodology

R284.3

A

1006-8783（2016）04-0420-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041903

2016-04-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81374072）

林勤（1991—），女，2014級(jí)碩士研究生，Email:731987501@qq.com；通信作者:趙越（1955—），女，教授，從事中藥新劑型與新技術(shù)、中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，Email:zybmbylk688@163.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-07-011 15:02 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160711.1502.008.html