李遠(yuǎn)宏,張逸飛，張慶成,徐　灣，鄒小倩,裴尚飛,趙珉生,姜　華

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇徐州 221004;2.空軍勤務(wù)學(xué)院航空軍需系,江蘇徐州 221000)

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谷類食品中克羅諾桿菌的分離與鑒定

李遠(yuǎn)宏1,張逸飛1，張慶成2,徐灣1，鄒小倩1,裴尚飛1,趙珉生1,姜華1

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,江蘇徐州 221004;2.空軍勤務(wù)學(xué)院航空軍需系,江蘇徐州 221000)

為了解谷類食品中克羅諾桿菌(Cronobacterspp.)的污染情況。本研究采集了100份谷類食品樣品,采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.40-2010分離克羅諾桿菌,并利用基于ITS和OmpA特異基因片段的PCR鑒定方法、16S rDNA基因序列分析等方法對(duì)可疑克羅諾桿菌進(jìn)行了初步的鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷類食品中克羅諾桿菌的污染率為21.0%,并分離出21株可疑克羅諾桿菌,其中17株(占總數(shù)的81.0%)被初步鑒定為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii),3株(占總數(shù)的14.2%)為都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis),1株(占總數(shù)的4.8%)可能為尤尼沃斯克羅諾桿菌(C.universalis)或蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis)。研究結(jié)果表明市售谷類食品中存在食源性克羅諾桿菌的污染,應(yīng)該加強(qiáng)谷類食品中克羅諾桿菌的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。

克羅諾桿菌,谷類食品,分離,鑒定

克羅諾桿菌(Cronobacterspp.),原阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii),是近年來嬰幼兒配方奶粉中引起廣泛關(guān)注的一種食源性條件致病菌。它是一種周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無芽孢的革蘭陰性細(xì)菌,在一定條件下可引起人和動(dòng)物致病[1]。近期的分類學(xué)研究結(jié)果表明該菌包括7個(gè)種:阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii),丙種二酸鹽陽(yáng)性克羅諾桿菌(C.malonaticus),蘇黎世克羅諾桿菌(C.turicensis),都柏林克羅諾桿菌(C.dublinensis),穆汀斯克羅諾桿菌(C.muytjensis),康迪蒙提克羅諾桿菌(C.condimenti)和尤尼沃斯克羅諾桿菌(C.universalis)[2]?？肆_諾桿菌主要通過嬰幼兒配方奶粉感染新生兒及嬰幼兒,特別是早產(chǎn)兒、低出生體重的嬰幼兒,引起腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病,死亡率高達(dá)20%～50%[3-4]。此外,研究表明該菌也能導(dǎo)致老年人和免疫力低下的人群致病[5]。

很多報(bào)道證實(shí)克羅諾桿菌主要的傳染源和傳播媒介是嬰兒配方粉,然而在奶酪、肉制品、谷物制品、香腸、香辛料、蔬菜等各種食品中也分離出了克羅諾桿菌[6-9]。此外,克羅諾桿菌還廣泛存在于食品生產(chǎn)企業(yè)的各種加工設(shè)備及生產(chǎn)環(huán)境中[10]。目前,不同學(xué)者對(duì)克羅諾桿菌的真正宿主、傳播途徑和致病機(jī)制還沒達(dá)成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。一些學(xué)者認(rèn)為嬰幼兒配方奶粉及其加工環(huán)境、面粉及其生產(chǎn)環(huán)境可能是克羅諾桿菌的天然儲(chǔ)藏場(chǎng)所,在克羅諾桿菌的傳播過程中起重要作用[11-12]。

董曉暉等[2]對(duì)非奶粉類食品中克羅諾桿菌的污染情況做定量檢測(cè),并從冷凍面條中分離出了克羅諾桿菌,檢出的克羅諾桿菌數(shù)量為0.62 MPN/g。張翼等[13]對(duì)嬰幼兒食品中克羅諾桿菌分離株的生物被膜形成能力進(jìn)行了研究,結(jié)果表明從嬰兒米粉和嬰兒面條等樣品中分離的克羅諾桿菌均具有一定生物膜成膜能力。污染了克羅諾桿菌的谷類食品將可能導(dǎo)致新生兒及嬰幼兒致病,但目前國(guó)內(nèi)外尚未有較為全面的關(guān)于谷類食品中克羅諾桿菌污染情況的研究資料。進(jìn)一步了解各類食品中克羅諾桿菌的分布特征和污染狀況可為預(yù)防該菌引起的疾病的爆發(fā)、流行及追蹤污染源提供理論依據(jù),具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。本文主要對(duì)常見谷類食品中克羅諾桿菌的污染狀況進(jìn)行了檢測(cè),并利用基于ITS(Internal Transcribed Spacer,內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))和OmpA(Outer membrane protein A,外膜蛋白A)基因片段的特異性PCR鑒定和16S rDNA基因序列分析等方法對(duì)可疑克羅諾桿菌進(jìn)行了初步的鑒定。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

谷類食品2014年9月至2015年6月,從湖南、湖北、江蘇、上海等地共采集谷類食品樣品100份,包括玉米碴13份,大米9份,紅豆8份,燕麥片和綠豆7份,黃豆、薏米、小黃米、蕎麥粉、小麥粉、糯米和黑米各6份;高粱米和黑豆各5份,西米4份(表1)。樣品采集完畢后立即送回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株阪崎克羅諾桿菌C.sakazakiiCICC 21560和穆汀斯克羅諾桿菌C.muytjensiiCICC 21563由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);緩沖蛋白胨水(BPW)、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(mLST)、萬(wàn)古霉素、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基HiCromeTMCronobacterspp. agar(配方:酪蛋白15.0 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,顯色混合物10.17 g/L,氯化鈉5.0 g/L,瓊脂15.0 g/L)美國(guó)sigma公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒美國(guó)Omega公司;2× Taq Master Mix南京諾唯贊生物科技有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

DNP9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海精宏;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)蘇州安泰;Veriti 96 PCR儀美國(guó)ABI公司;5418型小型高速離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc XR凝膠成像儀美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分離方法按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.40-2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》中的方法對(duì)100份谷類食品中的克羅諾桿菌進(jìn)行分離鑒定[14]。

1.2.2基因組DNA提取將純化后的可疑分離株接種于LB培養(yǎng)基中,置于搖床中于37 ℃,180 r/min過夜培養(yǎng),取過夜培養(yǎng)液1～2 mL,參照美國(guó)Omega公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明書提取細(xì)菌總DNA。

1.2.3PCR擴(kuò)增ITS基因特異性片段按照參考文獻(xiàn)[15]的方法采用PCR方法擴(kuò)增克羅諾桿菌ITS基因特異性片段。正向引物SG-F:5′-GGGTTGTCTG CGAAAGCGAA-3′;反向引物SG-R:5′-GTCTTC GTGCTGCGAGTTTG-3′。PCR反應(yīng)體系:2×Taq Master Mix 25 μL,引物SG-F和SG-R各2 μL,DNA模板1 μL,加水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,57 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4PCR擴(kuò)增OmpA基因特異性片段按照參考文獻(xiàn)[16]的方法采用PCR方法擴(kuò)增克羅諾桿菌OmpA基因特異性片段。正向引物ESSF:5′-GGATTTAACCGTGAACTTTTCC-3′;反向引物ESSR:5′-CGCCAGCGATGTTAGAAGA-3′。PCR反應(yīng)體系:2×Taq Master Mix 25 μL,引物ESSF和ESSR各2 μL,DNA模板1 μL,加水補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸50 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。反應(yīng)結(jié)束后,取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.516S rDNA基因擴(kuò)增及測(cè)序以細(xì)菌總DNA為模板,用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[17]。正向引物fD1:5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′和反向引物rP1:5′-ACGGTTACCTTGTT ACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系:2×Taq Master Mix 25 μL,引物(10 μmol/L)各2 μL,DNA模板1 μL,加無菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃變性45 s,55 ℃退火55 s,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送南京金思瑞生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序獲得的16S rDNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),用Blastn進(jìn)行序列同源性比對(duì)。采用Clustalx 2.0軟件將16S rDNA基因序列進(jìn)行多重比較后,利用MEGA 4.0軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1克羅諾桿菌污染情況

將在克羅諾桿菌顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈藍(lán)綠色,且在TSA平板上于25 ℃培養(yǎng)48 h呈黃色的菌落初步確定為可疑克羅諾桿菌分離株。通過顯色平板及TSA平板共檢出24份谷類食品樣本污染了克羅諾桿菌,檢出率為24.0%(表1)。對(duì)可疑分離株進(jìn)行了16S rDNA測(cè)序鑒定,結(jié)果最終證實(shí)21份谷類食品樣品污染了克羅諾桿菌,檢出率為21.0%(表1)。本研究從綠豆、紅豆、玉米、黃豆、蕎麥粉、小黃米、黑豆、小麥粉、糯米、燕麥、黑米和薏米等樣品中分離出了克羅諾桿菌,其中污染率較高的樣品有蕎麥粉(50%)、小麥粉(50%)和綠豆(42.9%)(表1)。

表1　不同谷類食品中克羅諾桿菌的污染率Table 1　Prevalence of Cronobacter isolates screened from various cereal samples

注:a:顯色平板法;b:16S rDNA測(cè)序結(jié)果;c:ND,未檢測(cè)(Not detected)。

2.2基于ITS基因的PCR驗(yàn)證結(jié)果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示24株可疑克羅諾桿菌分離株P(guān)CR檢測(cè)全部為陽(yáng)性,在250 bp附近出現(xiàn)目的條帶,和預(yù)期片段大小(282 bp)相吻合,而陰性對(duì)照(雙蒸水替代基因組DNA)未擴(kuò)增出目的片段(圖1)。

圖1　基于ITS基因的克羅諾桿菌分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.1　Detection of Cronobacter spp. isolated from cereal samples by PCR based on ITS gene注:Lane M:DL2000 DNA ladder;lane P1:陽(yáng)性對(duì)照(C. sakazakii CICC 21560);lane P2:陽(yáng)性對(duì)照(C. muytjensii CICC 21563);lane N:陰性對(duì)照;lanes 1～24:可疑克羅諾桿菌分離株。

2.3基于OmpA基因的PCR驗(yàn)證結(jié)果

從瓊脂糖凝膠電泳圖譜可知:經(jīng)PCR擴(kuò)增后,有21株分離株能擴(kuò)增出片段大小約為469 bp的目標(biāo)基因片段(圖2),表明這些分離株可能為克羅諾桿菌。然而分離株N1(17)、分離株N2(19)和分離株N3(21)未擴(kuò)增出目的片段,表明這些分離株可能不是克羅諾桿菌,分析可能的原因?yàn)榛贗TS基因的PCR檢測(cè)方法產(chǎn)生了假陽(yáng)性結(jié)果或基于OmpA基因的PCR檢測(cè)方法產(chǎn)生了假陰性結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本研究獲得的分離株是否為克羅諾桿菌,本研究擴(kuò)增了上述可疑分離株的16S rDNA基因片段,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證和BLAST在線比對(duì)分析。

圖2　基于OmpA基因的克羅諾桿菌 分離株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果Fig.2　Detection of Cronobacter spp. isolated from cereal samples by PCR based on OmpA gene注:Lane M:DL2000 DNA ladder;lane P1:陽(yáng)性對(duì)照(C. sakazakii CICC 21560);lane P2:陽(yáng)性對(duì)照(C. muytjensii CICC 21563);lane N:陰性對(duì)照;lanes 1～24:可疑克羅諾桿菌分離株。

2.4分離株16S rDNA測(cè)序結(jié)果

利用BLAST在線比對(duì)分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分離株16S rDNA基因序列,結(jié)果顯示21株可疑分離株均為Cronobacterspp.,其中大部分分離株(17株)的16S rDNA基因序列與C.sakazakii的相似性較高,序列相似性達(dá)99%以上;3株分離株的16S rDNA基因序列與C.dublinensis的相似性最高,序列相似性達(dá)99%以上;1株分離株的16S rDNA基因序列與C.universalis和C.turicensis的相似性高達(dá)99%以上(表2)。由于克羅諾桿菌屬內(nèi)不同種間菌株的16S rDNA基因序列相似性很高,通常無法通過16S rDNA基因序列比對(duì)的方法將其鑒定到種的水平,因而將本研究獲得的上述21株分離株初步鑒定為Cronobacterspp.。此外,BLAST比對(duì)分析結(jié)果表明分離株N1和N2為克雷伯菌屬(Klebsillaspp.),N3 為泛菌屬(Pantoeaspp.)(表2)。該結(jié)果與基于OmpA基因的PCR驗(yàn)證結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了分離株N1、N2和N3不是克羅諾桿菌,同時(shí)也表明基于ITS基因的特異性PCR驗(yàn)證方法產(chǎn)生了假陽(yáng)性結(jié)果。

表2　克羅諾桿菌分離株形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果Table 2　Morphology and molecular identification of Cronobacter isolates screened from cereal samples

注:+,陽(yáng)性;-,陰性。

2.5分離株系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步分析克羅諾桿菌分離株的變異及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,利用Mega 4.0軟件以16S rDNA基因序列為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析結(jié)果表明,21株分離菌株與克羅諾桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(C.sakazakiiATCC 29544、C.malonaticusLMG 23826、C.turicensisLMG 23827、C.dublinensissubsp.lactaridiLMG 23823、C.dublinensissubsp.lactaridiLMG 23824、C.dublinensissubsp.lactaridiLMG 23825、C.universalisNCTC 9529和C.muytjensiiATCC 51329)位于同一簇群,親緣關(guān)系較近,而與其他腸桿菌科細(xì)菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4),進(jìn)一步推斷本研究分離的上述21株可疑菌株為Cronobacterspp.。此外,分離株N1、N2和N3與克羅諾桿菌不在同一簇群,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),進(jìn)一步說明分離株N1、N2和N3不是克羅諾桿菌(圖3)。

3　結(jié)論與討論

采用準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法是實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中克羅諾桿菌的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的關(guān)鍵。常見的克羅諾桿菌分離鑒定方法主要有基于顯色平板的微生物培養(yǎng)法、基于特異性基因片段進(jìn)行PCR鑒定方法等,但是這2種檢測(cè)方法往往會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[18]。因此,有必要結(jié)合16S rDNA基因序列分析方法、rpoB基因序列分析方法、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)等方法對(duì)分離株進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證[19-20]。本研究采用GB 4789.40-2010分離了谷類食品中的克羅諾桿菌,并利用了基于ITS基因和OmpA基因的特異性PCR以及16S rDNA基因序列分析的方法對(duì)分離株進(jìn)行了初步的鑒定,最終從100份谷類食品樣品中分離出21株克羅諾桿菌,其中17株被初步鑒定為C.sakazakii,3株為C.dublinensis,1株為C.universalis或C.turicensis。國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中克羅諾桿菌污染狀況的調(diào)查結(jié)果表明食品中污染的克羅諾桿菌主要為C.sakazakii,與本研究的結(jié)果一致[21-22]。

不同種的克羅諾桿菌在致病性、耐藥性和耐干燥特性等方面具有較大差異。將分離株精確到種的水平對(duì)于追溯污染源、疾病的診斷和控制具有重要的意義。由于克羅諾桿菌不同種間菌株尤其是C.sakazakii和C.malonaticus之間的親緣關(guān)系較近,16S rDNA基因序列分析技術(shù)無法將其準(zhǔn)確鑒定到種,可通過PCR-限制酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)、PFGE和MLST等基因分型方法予以解決[22-24]。

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Isolation and identification ofCronobacterspp. from cereal foods

LI Yuan-hong1,ZHANG Yi-fei1,ZHANG Qing-cheng2,XU Wan1,ZOU Xiao-qian1,PEI Shang-fei1,ZHAO Min-sheng1,JIANG Hua1

(1.School of Public Health,Xuzhou Medical University,Xuzhou 221004,China;2.Department of Aviation Quartermaster,Air Force Logistics College,Xuzhou 221000,China)

To investigate the presence ofCronobacterspp. in cereal foods,a total of 100 cereal food samples were analyzed based on the national standard method of GB 4789.40-2010. The presumptive isolates was further identified by biochemical identification,PCR amplification of specific gene of ITS(internal transcribed spacer sequences)and OmpA,and sequence analysis of 16S rDNA. Twenty-one samples(21.0%)were positive forCronobacterspp.,and 21 isolates ofCronobacterwas collected in total. Most of theCronobacterisolates(81.0%)was identified asC.sakazakii,followed byC.dublinensis(14.2%),andC.universalisorC.turicensis(4.8%). The results indicated that commercially available cereal foods were possible reservoir ofCronobacterspp.,and therefore the epidemiological surveillance ofCronobacterspp. should be strengthened in cereal foods.

Cronobacterspp.;cereal foods;isolation;identification

2016-02-01

李遠(yuǎn)宏(1984-)，男，博士，講師，研究方向：食品微生物與生物技術(shù)，E-mail:lhy@xzmc.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31401595)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(20140313012)；江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201410313012Z)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)15-0154-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.022