徐萌萌,殷軍藝,萬宇俊,聶少平,謝明勇

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

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益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中不同方法制備的水溶性多糖理化特性

徐萌萌,殷軍藝,萬宇俊,聶少平,謝明勇*

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

本文主要研究益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖的理化特性,采用熱水浸提和直接離心取上清兩種方法從發(fā)酵胡蘿卜汁中制備多糖(分別記為WEP,CEP),比較兩者在中性糖含量、蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、相對分子質(zhì)量、紅外光譜、固體形貌等方面的差異性。結(jié)果顯示,WEP和CEP的基本理化性質(zhì)較為相似,但兩者的中性糖含量、蛋白含量還是存在一定差異性。通過高效凝膠滲透色譜法測得WEP和CEP的相對分子質(zhì)量和分布較為接近。WEP和CEP的紅外光譜均具有典型的多糖吸收峰,同時兩者均具有表面光滑的片狀形貌。上述結(jié)果表明,采用熱水浸提和直接離心取上清制備得到的益生菌發(fā)酵胡蘿卜水溶性多糖,結(jié)構(gòu)特征差異較小,這為今后益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中多糖的結(jié)構(gòu)和益生功能的深入研究提供參考。

益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁,水溶性多糖,理化特性

隨著消費(fèi)者生活水平、消費(fèi)觀念及消費(fèi)質(zhì)量的不斷提高,低熱量、低脂肪、低蛋白質(zhì)但富含膳食纖維的果蔬飲料越來越受到人們的青睞[1]。果蔬飲料中含有的多種維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維,可以補(bǔ)充人們膳食中容易缺乏的營養(yǎng)物質(zhì),并具有抗氧化、降低患冠心病、癌癥和許多慢性疾病的風(fēng)險等功效[2-4]。

胡蘿卜富含功能性成分如維生素和礦物質(zhì),尤其含有大量的胡蘿卜素,具有很高的營養(yǎng)價值[5]?，F(xiàn)代研究表明,胡蘿卜的保健功能有:提高機(jī)體的防癌抗癌能力[6];抗氧化,延緩衰老的功效[7];提高機(jī)體抵抗疾病的能力,并對 VA進(jìn)行安全補(bǔ)充的功能[8]。多糖作為維持生命活動正常運(yùn)轉(zhuǎn)的四大基本物質(zhì)之一[9],在生命活動中扮演著重要角色,有研究已證實(shí)某些多糖具有良好的生物活性功能,如免疫調(diào)節(jié)[10]、抗腫瘤[11]、降血糖功能[12]等。胡蘿卜中的多糖也具有一定的功能活性,闞郭仕[13]等報道胡蘿卜多糖能顯著降低小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯及丙二醛的含量,并促使超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增強(qiáng),對酒精肝損傷有一定預(yù)防作用。劉立新[14]等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)胡蘿卜多糖較強(qiáng)的清除·OH和抗自氧化作用以及能顯著性抑制二甲苯的致炎作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁及其多糖具有較好的功能活性[15],但該果汁中多糖的結(jié)構(gòu)特征還不明確。因此,本研究以益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁為原料,利用不同方式制備得到發(fā)酵胡蘿卜汁中的水溶性多糖,通過比較兩者在基本理化性質(zhì)、相對分子質(zhì)量、紅外吸收光譜以及固體形態(tài)方面的差異,試圖闡述發(fā)酵胡蘿卜汁中的水溶性多糖基本結(jié)構(gòu)特征,以及不同制備方法所得水溶性多糖結(jié)構(gòu)特征差異性,以期為后期益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中多糖的結(jié)構(gòu)與功能研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁購自南昌曠達(dá)生物科技有限公司。

半乳糖、半乳糖醛酸美國Sigma公司;Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.4%)美國Pharmacia公司;透析袋(截留分子量3500)上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250(進(jìn)口分裝)德國Fluk公司;牛血清蛋白(生化試劑)美國Amersco公司;無水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、疊氮鈉、濃硫酸等均為國產(chǎn)分析純。

Milli-Q超純水儀美國Millipore公司;ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機(jī)德國 Martin Christ公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Agilent 1260高效液相色譜美國安捷倫公司;Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀美國Thermo公司;ANKE TDL-5-A離心機(jī)上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司;N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海愛朗儀器有限公司,等。

1.2益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖的制備

水提多糖的制備:取發(fā)酵胡蘿卜汁適量,熱水浴(90 ℃)加熱2 h,4800 r/min離心10 min,收集上清液并通過真空濃縮至原體積的1/8,加入95%乙醇沉淀(終濃度為80%),收集多糖沉淀。多糖沉淀加水復(fù)溶,再用Sevag法[16](氯仿-正丁醇體積比為4∶1)脫蛋白(多糖與Sevag試劑比為3∶1),反復(fù)脫除至無明顯蛋白層,離心收集多糖溶液,并將多糖溶液進(jìn)行透析、凍干,得到多糖制品,記為WEP(Water Extracted Polysaccharide)。

上清液多糖的制備:取發(fā)酵胡蘿卜汁適量,4800 r/min離心10 min,收集上清液并通過真空濃縮至原體積的1/8,加入95%乙醇沉淀(終濃度為80%),收集多糖沉淀。多糖沉淀加水復(fù)溶,再用Sevag法[16](氯仿-正丁醇體積比為4∶1)脫蛋白(多糖與Sevag試劑比為3∶1),反復(fù)脫除至無明顯蛋白層,離心收集多糖溶液,并將多糖溶液進(jìn)行透析、凍干,得到多糖制品,記為CEP(Centrifugate Extracted Polysaccharide)。

多糖得率計算公式如下:

1.3基本理化性質(zhì)測定

以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn),苯酚-硫酸法測定中性糖含量[17],測定波長為490 nm。

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn),考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[18],測定波長為595 nm。

以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn),間羥基聯(lián)苯比色法測定糖醛酸含量[19],測定波長為530 nm。

上述中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量測定,計算公式為:樣品測定濃度/樣品實(shí)際濃度×100%。

1.4純度及相對分子質(zhì)量分析

將葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的溶液,并過0.22 μm濾膜制得一系列標(biāo)準(zhǔn)品,然后用 HPLC(Agilent 1260)進(jìn)行分析[20-21]。益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁的多糖樣品用超純水配成2 mg/mL 的溶液,過0.22 μm的濾膜同上述標(biāo)準(zhǔn)品一起按如下色譜條件檢測[22],色譜柱:UltrahydrogelTMLinear Column(7.8 mm×300 mm,10 μm),柱溫35 ℃;流動相為0.02% NaN3溶液,流速0.6 mL/min;檢測器為G1362A示差檢測器,檢測器溫度35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;ChemStation色譜工作站采集分析數(shù)據(jù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量和保留時間的線性關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,再利用多糖樣品的保留時間計算得到平均相對分子質(zhì)量。

1.5紅外光譜掃描分析

采用Thermo Nicolet 5700紅外光譜儀對發(fā)酵胡蘿卜汁多糖進(jìn)行紅外光譜掃描,KBr壓片,測定波數(shù)為4000～400 cm-1[23]。

1.6掃描電鏡

多糖經(jīng)過冷凍干燥處理,通過噴金將樣品固定在樣品臺上,最后置于SEM中觀察,加速電壓為5.0 kV。

1.7數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異比較(p<0.05)。

2　結(jié)果與分析

2.1基本理化性質(zhì)分析

經(jīng)過脫蛋白、透析、凍干等步驟得到兩種精多糖,通過比色法對WEP、CEP的中性糖含量和蛋白含量、糖醛酸含量進(jìn)行了測定(表1)。WEP和CEP的得率分別為0.11%和0.10%,WEP、CEP兩者糖醛酸含量較為接近,但中性糖含量和蛋白含量差異顯著(p<0.05)。

表1　益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖得率 和基本理化性質(zhì)分析(x±s,n=3)Table 1　Yield and basic physical-chemical properties of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics(x±s,n=3)

注:同一列字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2多糖純度及相對分子量

圖1為WEP與CEP的高效凝膠滲透色譜圖,圖中多糖分子質(zhì)量分布相對集中,由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在高效凝滲透色譜圖上保留時間和分子量關(guān)系建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,可推導(dǎo)、計算得到兩種多糖色譜圖(峰1、峰2和峰3)上對應(yīng)色譜峰的相對分子質(zhì)量,WEP的3個主峰平均相對分子質(zhì)量依次為1.10×106、2.95×105、3.02×103,峰面積相對含量依次為13.9%、75.9%、4.7%;CEP的3個主峰平均相對分子質(zhì)量依次為1.32×106、3.24×105、3.02×103,峰面積相對含量依次為17.6%、74.1%、4.1%。

圖1　益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖高效凝膠色譜圖Fig.1　HPGPC spectrum of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

2.3紅外光譜特征

圖2　益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖紅外光譜圖Fig.2　Infrared spectrum of water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

從兩種多糖的IR圖譜(圖2)可以得出以下結(jié)構(gòu)特征:在3432 cm-1附件處寬而強(qiáng)的吸收峰應(yīng)該為糖類O-H的伸縮振動。在3000～2800 cm-1之間出現(xiàn)的弱吸收峰應(yīng)該是甲基或亞甲基C-H的伸縮振動,為糖類的特征吸收峰,2938 cm-1附件的吸收峰為糖類C-H伸縮吸收峰。1741 cm-1處的吸收峰表明多糖中含有-COO基團(tuán),1622 cm-1是伯胺N-H鍵的彎曲振動吸收峰。1437 cm-1應(yīng)該為N-H的變角振動。1160～950 cm-1范圍內(nèi)的強(qiáng)吸收帶則被認(rèn)為是吡喃環(huán)的伸縮振動[24]。因此WEP和CEP的紅外光譜特征較為相似。

2.4SEM結(jié)果分析

SEM是表征多糖表觀形貌的常用手段,本研究采用SEM分析兩種提取方法多糖的表觀形貌的差異,結(jié)果如圖3:凍干后WEP與CEP的SEM圖,顯示二者均為片狀體,差異較小。

圖3　益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中WEP和CEP的SEM圖譜Fig.3　The SEM images of polysaccharides extracted from carrot juice fermented by probiotics注:A1和A2分別為WEP在不同倍數(shù)下的SEM圖譜, B1和B2分別為CEP在不同倍數(shù)下的SEM圖譜。

3　結(jié)論

本文以益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁為研究對象,研究了其水溶性多糖基本結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果顯示益生菌發(fā)酵胡蘿卜汁中水溶性多糖中含有較高的糖醛酸,主要組分的平均相對分子質(zhì)量大約為300000,SEM圖譜顯示其具有片狀固體形貌。無論是通過直接離心取上清制備水溶性多糖,還是通過熱水浸提獲取多糖組分,兩種方法制備所得多糖的得率和基本理化性質(zhì)差異比較小。上述結(jié)果將對以后的益生菌發(fā)酵胡蘿卜中多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能特性(如免疫調(diào)節(jié)、腸道微生態(tài)改善等)機(jī)理研究提供參考。

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Physicochemical property of different water-soluble polysaccharide from carrot juice fermented by probiotics

XU Meng-meng,YIN Jun-yi,WAN Yu-jun,NIE Shao-ping,XIE Ming-yong*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

To explore physicochemical property of water-soluble polysaccharide from the carrot juice fermented by probiotics. The polysaccharide was extracted by two different ways including hot water extraction or centrifugate extraction. The obtained fractions were named as water extracted polysaccharide(WEP)and centrifugate extracted polysaccharide(CEP),respectively. Structural characteristics differences between WEP and CEP among neutral sugar content,protein content,uronic acid content,relative molecular weight,infrared spectrum and morphology appearance were highlighted. The results showed that basic physical-chemical properties between the two fractions were similar. However,the differences of neutral sugar and protein contents between WEP and CEP were significant. HPGPC showed that the relative molecular weight and its distribution of WEP and CEP were similar. The typical polysaccharide absorption peak was both found in IR spectra of WEP and CEP. Scanning electron microscopy showed that the WEP and CEP was lamellar with smooth surface. In conclusion,there was little difference in the structural characteristics,between the water soluble polysaccharide produced by water extraction and centrifugation directly. The research would guide further study on structure and function of polysaccharides of carrot juice fermented by probiotics.

carrot juice fermented by probiotics;water soluble polysaccharide;physicochemical property

2016-03-01

徐萌萌(1989-)，女，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)與工程,E-mail：m18702528287@163.com。

謝明勇(1957-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)，食品營養(yǎng)與安全,E-mail:myxie@ncu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31571826)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)15-0125-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.016