牛 堅(jiān)，王 月，劉 斌，王人顥，朱志軍，申海蓮

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survivin啟動(dòng)子調(diào)控腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD133基因siRNA增殖型溶瘤腺病毒的構(gòu)建及對(duì)肝癌細(xì)胞生長的抑制作用

牛 堅(jiān)1，王 月1，劉 斌1，王人顥1，朱志軍2，申海蓮3

目的 構(gòu)建survivin啟動(dòng)子調(diào)控的靶向CD133基因的siRNA增殖型溶瘤腺病毒，研究其對(duì)肝癌細(xì)胞生長的影響。方法 RT-PCR法擴(kuò)增survivin啟動(dòng)子，測(cè)序鑒定，雙酶切連接，獲得pH-XC2-survivin。酶切pH-XC2-survivin、pZD55-CD133-siRNA獲得survivin啟動(dòng)子表達(dá)框的亞克隆和CD133-siRNA基因表達(dá)框的亞克隆，連接獲得survivin啟動(dòng)子調(diào)控的siRNA增殖型溶瘤腺病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pT-ZD55-CD133-siRNA。增殖型溶瘤腺病毒survivin-T-ZD55-CD133-siRNA經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定。qRT-PCR法檢測(cè)CD133表達(dá)，Western blot法檢測(cè)E1A，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞生長，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 成功構(gòu)建增殖型溶瘤腺病毒survivin-T-ZD55-CD133-siRNA。qRT-PCR法檢測(cè)CD133 mRNA明顯下降，Western blot證實(shí) survivin-T-ZD55-CD133-siRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)E1A能抑制肝癌細(xì)胞CD133表達(dá)及生長。結(jié)論 構(gòu)建的增殖型溶瘤腺病毒可有效降低肝癌細(xì)胞CD133的表達(dá)，用于肝癌基因治療的進(jìn)一步研究。

主題詞 肝癌；干細(xì)胞；CD133；細(xì)胞增殖；基因表達(dá)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-6-6 13：52：31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.004.html

腫瘤干細(xì)胞是指存在于腫瘤組織中的數(shù)量很少但有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體［1-2］，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，同時(shí)也在腫瘤耐藥性、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。CD133是肝癌干細(xì)胞表面特征性的標(biāo)志物［4］。靶向性是腫瘤基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。實(shí)現(xiàn)靶向性的手段之一就是利用特異性的基因表達(dá)調(diào)控序列使治療基因序列在腫瘤細(xì)胞中特異表達(dá)。survivin基因的特點(diǎn)是在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平高，但是在相應(yīng)的正常組織少有表達(dá)［5］。據(jù)此可以利用survivin基因的啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞表達(dá)的特異性而作為腫瘤基因治療的新的靶向性調(diào)控序列。該研究通過構(gòu)建survivin基因啟動(dòng)子調(diào)控的針對(duì)CD133的siRNA增殖型溶瘤腺病毒，探討該增殖型溶瘤腺病毒對(duì)人肝癌細(xì)胞系Hep3B的生物學(xué)行為影響，探索肝癌基因治療的新的方法。

1　材料與方法

1.1材料 293T細(xì)胞、pH-XC2、pZD55、pZD55-EGFP、pZD55-CD133-siRNA由上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞研究中心惠贈(zèng)；人肝癌細(xì)胞系Hep3B（缺乏正常p53活性）由徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝病研究中心保存；E1A、E1B一抗購自美國Santa Cruz公司；CCK-8試劑盒購自日本DOJINDO公司。

1.2survivin啟動(dòng)子的RT-PCR擴(kuò)增及鑒定 根據(jù)survivin啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物：5′-ACGTTACGTACGCGTTCTTTGAAAGCAGTC-3′，下游引物：5′-TATACTCGAGCCAGGCAGGGGGCAACGT-3′；以上引物分別含有SnaBⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點(diǎn)。以HeLa細(xì)胞的基因組DNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增survivin啟動(dòng)子。PCR產(chǎn)物回收純化同時(shí)測(cè)序分析。

1.3穿梭質(zhì)粒pH-XC2-survivin的構(gòu)建 survivin啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以SnaBⅠ和XhoⅠ分別雙酶切，連接至同樣雙酶切的pH-XC2（E1A區(qū)缺少啟動(dòng)子的增殖型溶瘤腺病毒質(zhì)粒）中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，擴(kuò)增，用轉(zhuǎn)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，測(cè)序，提取質(zhì)粒名為pH-XC2-survivin。

1.4穿梭質(zhì)粒survivin-pT-ZD55-CD133-siRNA的構(gòu)建 EcoR V、ClaⅠ酶切pH-XC2-survivin獲得包含survivin啟動(dòng)子表達(dá)框的亞克隆；EcoR V、ClaⅠ酶切pZD55-CD133-siRNA獲得包含CD133-siRNA基因表達(dá)框的亞克?。簧鲜?個(gè)亞克隆進(jìn)行連接，獲得survivin-pT-ZD55-CD133-siRNA。

1.5病毒的包裝、鑒定 將質(zhì)粒survivin-pT-ZD55-CD133-siRNA、pZD55-EGFP分別與腺病毒右臂質(zhì)粒pBHGE3，通過Lipofectamin2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)過病毒空斑純化，包裝成完整病毒顆粒。提取重組病毒DNA，測(cè)序鑒定正確者，即為目的病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA、ZD55-EGFP。

1.6survivin-ZD55-CD133-siRNA的 PCR鑒定病毒感染細(xì)胞，待細(xì)胞病變后，收集細(xì)胞上清液，抽提病毒DNA。RT-PCR檢測(cè)重組腺病毒是否插入目的基因，上游引物：5′-TCGTTTACTGAACCGTCAGATC-3′，下游引物：5′-ACACGGTCTCGTAGGTCAAG-3′，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.7病毒滴度的測(cè)定 病毒滴度的測(cè)定參考文獻(xiàn)［6］。

1.8細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞用含10%的小牛血清DMEM常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處在對(duì)數(shù)生長期。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分為：① Blank組：Hep3B；②shNC組：Hep3B-ZD55-EGFP；③ shCD133組：Hep3B-survivin-ZD55-CD133-siRNA。

1.9熒光定量PCR檢測(cè)CD133在mRNA水平的變化 將Hep3B細(xì)胞低密度鋪于6孔板，1 d后用感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10的survivin-pT-ZD55-CD133-siRNA感染細(xì)胞，48 h后TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物序列為上游引物：5′-TGCTCAGAACTTCATCACAAACAAT-3′，下游引物：5′-TAGGACAATACTGTTCGGGTAGTGT-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′，下游引物：5′-CAGTGTACAGGTAAGCCCTG-3′。qRTPCR循環(huán)參數(shù)：第一步95℃預(yù)變性30 s，1個(gè)循環(huán)；第二步95℃、5 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)；第三步：熔解曲線95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s。數(shù)值分析采用最大二階導(dǎo)數(shù)法（2-ΔΔCt）分析。

1.10Western blot法檢測(cè)E1A、E1B蛋白表達(dá)將Hep3B細(xì)胞低密度鋪于6孔板，24 h后用MOI= 10.0的survivin-ZD55-CD133-siRNA感染細(xì)胞，48 h后提取蛋白和蛋白緩沖液混合，煮沸后上檢測(cè)蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳停止后，電轉(zhuǎn)移法將細(xì)胞蛋白分離到PVDF膜上。一抗（1∶1 000），二抗（1∶5 000）室溫孵育后，PVDF膜用 ECL發(fā)光檢測(cè)盒反應(yīng)并在暗室顯影。

1.11survivin-ZD55-CD133-siRNA對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響 具體操作參照Cell Counting Kit-8試劑盒操作說明。在酶聯(lián)免疫測(cè)試儀上測(cè)定各樣品吸光度（optical density，OD）值繪制生長曲線，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)對(duì)象1周的擴(kuò)增情況。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.12細(xì)胞凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染24 h后，收集Blank組、shNC組和shCD133組細(xì)胞后加入20 ng/ml表皮生長因子（EGF）及10 ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）的無血清DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)96 h后，用AnnexinV/FITC和PI染色，樣品用流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 6.12軟件進(jìn)行方差和t檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2　結(jié)果

2.1survivin啟動(dòng)子有效片段PCR擴(kuò)增 以HeLa細(xì)胞DNA為模板，PCR擴(kuò)增 survivin啟動(dòng)子有效片段，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，得到約298 bp大小的DNA片段，見圖1。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確。

圖1　survivin啟動(dòng)子片段PCR電泳圖

2.2survivin-ZD55-CD133-siRNA鑒定和滴度測(cè)定 用survivin-ZD55-CD133-siRNA病毒DNA作為PCR反應(yīng)模板，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可觀察到在約500 bp的位置有一條帶，與作為陽性對(duì)照的pT-ZD55-CD133-siRNA相同，與作為陰性對(duì)照的pZD55，在約436 bp的位置有一條帶，表明survivin-ZD55-CD133-siRNA含有干擾序列。見圖2。

圖2　增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA鑒定

2.3Western blot法檢測(cè)結(jié)果 E1A基因保留了病毒在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。剔除了E1B（55 ku）基因，使病毒不能在正常細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。這兩個(gè)方面都需要驗(yàn)證。結(jié)果表明，增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA、ZD55-EGFP感染 Hep3B細(xì)胞48 h后，可以檢測(cè)到E1A的表達(dá)，而 Hep3B組沒有E1A的表達(dá)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)顯示3組無E1B的表達(dá)。見圖3。

圖3　Western blot法檢測(cè)Hep3B感染增殖型溶瘤腺病毒后E1A蛋白的表達(dá)

2.4qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果 各組重組增殖型溶瘤腺病毒顆粒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞Hep3B后，qRT-PCR結(jié)果顯示：以Blank組表達(dá)量為1，shCD133組相對(duì)Blank組的CD133表達(dá)量的平均值為0.18±0.04，CD133的相對(duì)表達(dá)量下調(diào)了80%，shNC組相對(duì)Blank組表達(dá)量的平均值為0.96±0.06。shCD133組相對(duì)Blank組有顯著的敲減作用（F=25.9，P＜0.05），Blank組和shNC組表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響 shCD133組、Blank組和shNC組細(xì)胞生長曲線顯示shCD133組細(xì)胞生長明顯減慢（P＜0.05）。見圖4。

圖4　shCD133組、Blank組和shNC組生長曲線

2.6增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響 為了探討增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用是否依賴細(xì)胞凋亡性死亡，本研究采用AnnexinV/PI染色分析細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，與Blank組（25.3%，F(xiàn)=36.9，P＜0.05）、shNC（24.3%，F(xiàn)=46.9，P＜0.05）比較，shCD133組細(xì)胞陽性凋亡比例（41.3%）顯著增加（圖5）。

圖5　AnnexinV/PI檢測(cè)survivin-ZD55-CD133-siRNA對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡影響

3　討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的關(guān)鍵是由那些能自我更新、無限增殖及多向分化潛能的干細(xì)胞亦即腫瘤干細(xì)胞引起的。腫瘤干細(xì)胞在很多實(shí)體瘤中普遍存在［7-8］。

CD133是一個(gè)5次跨膜糖蛋白，表達(dá)在未分化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，是最重要的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。CD133分子在胰腺癌［9-10］、肝細(xì)胞肝癌［11］及結(jié)直腸癌［12］等腫瘤組織中有明顯表達(dá)，通過對(duì)腫瘤細(xì)胞膜突起的改變而影響細(xì)胞的極性、遷移及與相鄰細(xì)胞的作用［13］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建增殖型溶瘤腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA沉默 CD133基因，為CD133基因的功能研究提供有效手段。

腫瘤基因治療的難點(diǎn)是將治療基因特異且高效的導(dǎo)入癌細(xì)胞中，同時(shí)實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，這就要求構(gòu)建高靶向性的載體，這也是腫瘤基因治療中被高度關(guān)注的領(lǐng)域［14］。近年增殖型溶瘤腺病毒成為研究的熱點(diǎn)之一，以其為基礎(chǔ)構(gòu)建腫瘤基因治療的載體，優(yōu)點(diǎn)是可以充分利用腺病毒顆粒較小、擴(kuò)散能力快的特點(diǎn)，與此同時(shí)大量擴(kuò)增的病毒可以直接分解被感染的腫瘤細(xì)胞，還能感染附近的腫瘤細(xì)胞。增殖型溶瘤腺病毒載體一方面在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性擴(kuò)增，另一方面還能將嵌合的外源基因的表達(dá)量放大成千上萬倍，這極大增加了腫瘤的治療效果，現(xiàn)已有利用增殖型腺病毒治療腫瘤的實(shí)驗(yàn)報(bào)道［15］。本實(shí)驗(yàn)顯示增殖型溶瘤腺病ZD55-EGFP對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長有明顯抑制作用。

治療基因進(jìn)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)高效、特異的表達(dá)，是需要解決的重要問題，而利用腫瘤細(xì)胞的特異性啟動(dòng)子控制治療基因表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)腫瘤基因治療的重要手段。

本研究成功構(gòu)建survivin啟動(dòng)子替換表達(dá)CD133-siRNA的增殖型腺病毒ZD55-CD133-siRNA的E1A啟動(dòng)子，經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定證實(shí)survivin啟動(dòng)子調(diào)控靶向CD133基因siRNA增殖型腺病毒survivin-ZD55-CD133-siRNA構(gòu)建成功。對(duì)肝癌 Hep3B細(xì)胞進(jìn)行體外研究表明構(gòu)建的靶向CD133基因siRNA增殖型腺病毒對(duì)Hep3B細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，較對(duì)照組更易誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究所改造的增殖型腺病毒表達(dá)載體在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中都有重要的作用。

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Construction and identification of replication-competent adenovirus expressing siRNA targeting CD133 gene regulated by survivin promoter and its inhibition of liver cancer cell growth

Niu Jian，Wang Yue，Liu Bin，et al
（Liver Disease Research Center，The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221004）

Objective To construct a replication-competent adenovirus expressing siRNA targeting CD133 gene regulated by survivin promoter and investigate its inhibitory effect on Hep3B cells.Methods The fragment of the survivin promoter was amplified by PCR and inserted into pH-XC2 to reconstruct a recombinant plasmid pH-XC2-survivin.Complete digestion pH-XC2-survivin and pZD55-CD133-siRNA，combinational joining the subclones，then getting replication-competent adenovirus expressing short interference RNA targeting CD133 gene regulated bysurvivin promoter，replication-competent adenovirus was constructed.The recombined adenoviruses（T-ZD55-CD133-siRNA）were verified by PCR and sequencing.The effect of T-ZD55-CD133-siRNA on CD133 expression in Hep3B cells was detected by qRT-PCR.The expression of E1A was detected by Western blot.The antitumor potential of replication-competent adenovirus in Hep3B cells were evaluated by CCK-8 assay and cell apoptosis was detected by Flow cytometry.Results Replication-competent adenovirus were constructed successfully.Western blot analyses indicated that T-ZD55-CD133-siRNA might express E1A in adenovirus-infected Hep3B cells.TZD55-CD133-siRNA were more effective to inhibit CD133 mRNA expression and Hep3B cells proliferation.Apoptosis was significantly increased in the interference group compared with the control group.Conclusion Survivin-T-ZD55-CD133-siRNA expressing CD133-siRNA can inhibit CD133 expression and may be used for further investigation of gene therapy for liver cancer.

liver cancr；cancer stem cell；CD133；cell proliferation；gene expression

R 349.5

A

1000-1492（2016）07-0926-05

2016-04-16接收

天晴甘美基金項(xiàng)目資助（編號(hào)：CFHPC20132020）；江蘇省333人才項(xiàng)目（編號(hào)：Ⅲ-2290）；徐州市重大科研項(xiàng)目（編號(hào)：KC14SX011）

1徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝臟病研究中心，徐州 2210022北京友誼醫(yī)院肝膽外科，北京 1000003上海交通大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞研究中心，上海200000

牛 堅(jiān)，男，副教授，責(zé)任作者，E-mail：njnj_001@163.com