冉寶石，王 偉，王 剛，孫玉蓓，王保龍，季楚舒

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自體DC-CIK細胞治療晚期實體瘤患者的療效分析

冉寶石，王 偉，王 剛，孫玉蓓，王保龍，季楚舒

目的 研究樹突狀細胞聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（DC-CIK）治療對晚期腫瘤患者免疫系統(tǒng)影響及臨床療效。方法 選取60例患者，分為兩組，試驗組行兩周期DCCIK治療，對照組未治療，對比試驗前后外周血免疫細胞比例及生活質(zhì)量變化，觀察療效及不良反應(yīng)。結(jié)果 試驗組總緩解率為0，疾病控制率約36.67%，外周血CD4+T細胞、自然殺傷細胞（NK）及CIK細胞比例較前升高（P＜0.05），CD8+T細胞比例下降（P＜0.05），患者生活質(zhì)量較前改善，不良反應(yīng)為低熱、過敏等；對照組CD4+T細胞、NK細胞及CIK細胞比例較前下降（P＜0.05），而CD8+T細胞比例升高（P＜0.05），患者生活質(zhì)量較前下降。兩組B細胞比例均無明顯變化。結(jié)論 DC-CIK可改善晚期實體瘤患者免疫功能和一般狀況，在臨床治療中有一定療效，且副作用小，可作為放化療失敗后的選擇之一。

樹突狀細胞；細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞；晚期實體瘤；淋巴細胞亞群；生活質(zhì)量

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-6-6 13：52：32 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160606.1352.062.html

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）聯(lián)合細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells，CIK）免疫治療作為繼手術(shù)、化療、放療及靶向治療之外的另一腫瘤治療方法，不僅可以抑制或殺傷惡性腫瘤，還有助于恢復(fù)患者自身免疫系統(tǒng)，提升抗腫瘤能力，其良好的療效得到臨床廣泛認可［1-2］。DC細胞通過識別抗原激活獲得性免疫系統(tǒng)，而CIK細胞則通過自身細胞毒性及分泌細胞因子殺傷腫瘤細胞，二者聯(lián)合培養(yǎng)的DC-CIK細胞有更強的增殖活性和抗腫瘤活性［3-4］。針對晚期腫瘤患者，常因病期較晚、患者身體狀況較差、歷經(jīng)多種常規(guī)治療后病情仍然進展等難題缺乏行之有效的治療手段，DC-CIK免疫治療的出現(xiàn)為這類患者帶來了新的曙光。該試驗擬研究DC-CIK治療晚期腫瘤患者的臨床療效、免疫作用、對生活質(zhì)量的影響以及治療的不良反應(yīng)。

1　材料與方法

1.1病例資料 入選標準：①經(jīng)病理學(xué)確診，并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標準劃分為Ⅳ期的惡性實體瘤患者；②既往行手術(shù)、放療、一二線化療或介入治療后效果不佳或無法耐受上述治療的患者；③KPS評分≥60分，預(yù)計生存期＞3個月；④除外合并嚴重心、肝、腎功能不全，造血系統(tǒng)和其它免疫系統(tǒng)疾病，哺乳或懷孕婦女，精神病患者。

隨機選取2014年1月～2015年3月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤化療科的60例晚期腫瘤患者，病種包括腎癌20例，惡性黑色素瘤20例，胃癌4例，食管癌4例，結(jié)直腸癌4例，卵巢癌4例，輸尿管癌2例，子宮內(nèi)膜癌2例，多伴有肺、肝、骨、腹腔或腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。各病種患者平均分成試驗組及對照組，每組各30例，其中試驗組男20例，女10例，年齡（63.27±11.27）歲；對照組男22例，女8例，年齡（60.26±14.63）歲，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。患者均符合入組標準，試驗組的DC-CIK治療已獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，均被告知相關(guān)治療風(fēng)險并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DC培養(yǎng) 采用血細胞分離機分離出患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），F(xiàn)icoll密度梯度離心法提取淋巴細胞，充分洗滌，BTN無血清培養(yǎng)液混懸于8張6孔培養(yǎng)板，置于37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)2 h。將懸浮細胞與疏松貼壁細胞分離，貼壁細胞用粒細胞巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、腫瘤壞死因子α（tumor nectosis factoralphagene，TNF-α）按一定比例及順序誘導(dǎo)分化，定期觀察細胞長勢并及時補充培養(yǎng)液和細胞因子，同時檢查有無細菌、真菌及支原體感染。

1.2.2CIK細胞培養(yǎng) 將上述采集的懸浮細胞使用含一定比例的CD3單克隆抗體、IFN-γ、IL-2、患者自體滅活血清、滅活小牛血清、慶大霉素的BTN無血清培養(yǎng)液，37.5℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察細胞長勢并補充培養(yǎng)液及細胞因子，同時檢查有無細菌、真菌及支原體感染。

1.2.3DC與CIK細胞共培養(yǎng) 將培養(yǎng)4 d后的DC與CIK細胞共培養(yǎng)，按1∶10比例混合，采用CIK細胞的培養(yǎng)環(huán)境，4 d后檢查有無細菌、真菌及支原體感染。

1.3細胞回輸 細胞培養(yǎng)成熟后，經(jīng)細菌、真菌、支原體檢測為陰性，且臺盼藍染色活細胞＞95%時，采集DC-CIK細胞，生理鹽水洗滌3次，加入含患者自體滅活血清的生理鹽水中，以細胞數(shù)為（1～3）× 109/次靜脈回輸。

1.4臨床療效觀察內(nèi)容 試驗組：患者兩個療程DC-CIK細胞回輸后行療效評估及不良反應(yīng)評價，治療前后用流式細胞術(shù)行外周血T、B、NK細胞亞群及CD3+CD56+細胞亞群測定等，EORTC-QLQ量表評估患者生活質(zhì)量變化。對照組：采取試驗前后隨訪并抽取部分外周血行細胞亞群檢測，同時填寫EORTC-QLQ量表。

1.5療效評價指標 對實體瘤患者采用RECIST療效評價標準，主要以CT、MRI、超聲等檢查對病灶行2周期評效。① 完全緩解（complete remission，CR）：所有目標病灶消失；② 部分緩解（partial remission，PR）：病灶長徑總和縮小≥30%；③腫瘤穩(wěn)定（stable disease，SD）：病灶長徑總和有縮小但未達PR或有增加但未達（progression disease，PD）；④PD：病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶。CR與PR所占百分比為客觀緩解率（objective response rate，ORR），CR、PR、SD所占百分比為疾病控制率（disease control rate，DCR）。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量資料免疫細胞比例采用中位數(shù)M表示，檢驗采用自身配對的Wilcoxon符號秩和檢驗；生活質(zhì)量EORTC-QLQ量表以±s表示，檢驗采用配對樣本均數(shù)的t檢驗，兩種檢驗均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1療效評價及不良反應(yīng) 根據(jù)RECIST評效標準，試驗組患者中CR為0例，PR為0例，SD為11例（36.67%），PD為19例（63.33%），ORR為0.00%，DCR約36.67%。SD患者中部分腫瘤標志物出現(xiàn)下降，PD患者的腫瘤標志物均為上升。對照組未能配合完成影像學(xué)評估，根據(jù)隨訪和患者臨床表現(xiàn)推斷整體病情進展。治療的不良反應(yīng)主要為回輸后1～6 h內(nèi)出現(xiàn)體溫升高，最高溫度為37.2℃，可自行降至正常，例數(shù)為10例，約占33.3%；有1～3例出現(xiàn)失眠、頭暈等現(xiàn)象，另有1例在回輸?shù)?療程中出現(xiàn)頸胸處過敏現(xiàn)象（既往無此類過敏史），對癥處理后好轉(zhuǎn)。

2.2細胞亞群變化 試驗組患者均進行兩療程的DC-CIK治療，患者治療后外周血中 CD3+CD4+T細胞比例增加，CD3+CD8+T細胞比例降低，CD4+/ CD8+T細胞之比增大，CD3-CD16+CD56+NK細胞、CD3+CD56+細胞比例增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。CD3-CD19+B細胞比例、CD3+CD56-細胞比例較治療前略降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、表1。對照組患者外周血中 CD3+CD4+T細胞、CD3-CD16+CD56+NK細胞、CD3+CD56+細胞比例較前下降，而CD3+CD8+T細胞比例升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。CD3-CD19+B細胞比例無明顯變化。見圖2、3，表1。

圖1　DC及CIK細胞培養(yǎng)前后的形態(tài)學(xué)變化×400

2.3生活質(zhì)量變化 試驗組患者生活質(zhì)量變化通過EORTC-QLQ評分量表評估，該評分量表主要用于惡性腫瘤患者生活質(zhì)量測定，除總健康情況得分與生活質(zhì)量成正比外，其余項目均與生活質(zhì)量成反比。將患者治療前后評分匯總后進行統(tǒng)計分析，可以看出患者治療后生活質(zhì)量在角色/認知/社會功能、總健康狀況、惡心嘔吐、氣促、失眠、便秘、腹瀉方面有所改善（P＜0.05，P＜0.01）。對照組患者試驗后角色/社會/認知功能、總健康狀況、惡心嘔吐、氣促、失眠、腹瀉、便秘等方面較前惡化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余各項差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

3　討論

惡性腫瘤是一種全身性疾病，人體對腫瘤細胞的防御以T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主，而腫瘤細胞可通過MHC-Ⅰ/Ⅱ表達缺失、削弱APC的抗原提呈功能等不同途徑進行逃逸［5］。DC-CIK細胞可在一定程度上阻斷上述逃逸過程，增強機體特異性及非特異性殺瘤效應(yīng)，從而使患者病情得到控制，生活質(zhì)量改善［6］。

DC-ClK細胞治療已成為腫瘤治療的新興輔助手段之一。DC-ClK治療主要作用機理為：①DC作為體內(nèi)功能最強的APC，將腫瘤抗原呈遞給Th細胞（T helper cells，Ths），而腫瘤細胞可抑制DC功能，晚期腫瘤患者體內(nèi)DC數(shù)量減少更為顯著［6-9］，故增加患者體內(nèi)DC細胞數(shù)量可提升自身免疫；②CIK細胞即為CD3+CD56+細胞，回輸后患者體內(nèi)所占比例明顯增加。腫瘤細胞通過降低Fas表達逃避免疫細胞攻擊，而CIK細胞則通過分泌大量細胞因子、啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)增加CIK細胞對腫瘤細胞的細胞毒作用［10］。本研究顯示，通過兩周期DCCIK治療后評效，患者臨床獲益率有36.67%，說明免疫治療可使病情穩(wěn)定，同時觀察到治療后患者疼痛、疲倦感減輕，總體健康狀況得到改善，故DC-CIK在晚期放化療失敗后患者的治療中有較好的應(yīng)用價值。

圖2　DC-CIK治療前后各細胞亞群表達

圖3　對照組試驗前后各細胞亞群比例變化

T細胞包括CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞，其中CD3+CD4+T細胞又稱Th細胞，可被APC表面的MHC-Ⅱ遞呈的多肽抗原激活，從而促進CD8+T細胞分化為細胞毒T細胞（cytotoxic T cell，CTL），同時促進B細胞增殖分化，調(diào)節(jié)體液免疫，而腫瘤細胞可產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制T細胞增殖。本試驗顯示患者回輸后外周血中Th細胞中位數(shù)由38.00%增加為50.40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；CIK細胞兼具T細胞和NK細胞活性，患者回輸后其細胞比例中位數(shù)由3.75%增加至4.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；NK細胞是機體重要的免疫監(jiān)視細胞，介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，能直接殺傷腫瘤細胞，也可發(fā)揮抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用，刺激后可分泌IFN-γ、THF-α等細胞因子，其數(shù)值高低可作為機體抗腫瘤能力強弱的指標之一?；颊咝蠨C-CIK細胞治療后，外周血中 NK細胞比例較前增加，機體抗腫瘤能力提高?；颊呋剌敽蟪霈F(xiàn)的不良反應(yīng)主要為體溫升高、過敏，可能因為免疫細胞在體內(nèi)釋放大量白介素、干擾素［11］，另外Th細胞突然增加，Ts細胞比例降低，使機體免疫反應(yīng)過強所致［12］，以上不良反應(yīng)經(jīng)對癥處理后好轉(zhuǎn)。

表1　患者治療前后外周血免疫細胞亞群比例變化（中位數(shù)M）

表2　患者治療前后EORTC-QLQ評分變化（±s）

表2　患者治療前后EORTC-QLQ評分變化（±s）

評價內(nèi)容　對照組（n=30）試驗前　試驗后　P值試驗組（n=30）治療前　治療后　P值軀體功能　2.38±0.85　2.62±0.70　0.156　2.18±0.95　1.73±0.93　0.625角色功能　2.42±0.79　2.58±0.72　0.020　2.48±0.95　1.88±0.88　0.013情感功能　2.19±0.54　2.43±0.69　0.158　1.62±0.59　1.29±0.38　0.069認知功能　2.43±0.76　2.67±0.75　0.055　2.03±0.86　1.73±0.89　0.000社會功能　2.72±0.60　3.02±0.61　0.004　2.55±0.80　2.28±0.84　0.000總體健康狀況　4.23±1.00　3.47±1.17　0.023　4.05±1.13　5.55±0.99　0.025疲乏　2.71±0.64　2.89±0.72　0.058　2.46±0.83　1.51±0.62　0.097惡心/嘔吐　1.65±0.66　1.88±0.67　0.004　1.63±0.61　1.12±0.28　0.011疼痛　2.18±0.86　2.48±0.85　0.095　2.02±1.01　1.28±0.50　0.119氣促　1.93±0.87　2.17±0.79　0.000　2.07±1.08　1.53±0.73　0.002失眠　2.67±0.88　3.03±0.81　0.000　2.47±0.97　1.60±0.67　0.010食欲喪失　2.70±0.84　3.00±0.83　0.000　2.57±1.07　1.43±0.63　0.106便秘　1.27±0.52　1.13±0.35　0.001　1.63±0.81　1.13±0.35　0.004腹瀉　1.57±0.68　1.57±0.73　0.000　1.57±0.68　1.13±0.35　0.000

本研究還表明DC-CIK治療后患者體內(nèi)的CD8+T細胞比例降低，平均由32.50%降至21.40%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。分析此現(xiàn)象機理如下：在T細胞活化過程中，需要有協(xié)同刺激分子B7家族的參與，后者若與T細胞表面的CD28識別可產(chǎn)生正性第二信號，使T細胞活化增殖，而與T細胞表面的CTLA-4結(jié)合則產(chǎn)生負性第二信號，抑制T細胞發(fā)揮免疫作用，因此CD8+T淋巴細胞既可成為CTL，也可成為抑制性T細胞（Ts）。腫瘤細胞中往往缺乏共刺激信號B7分子，當其處于低水平時，與CTLA-4的結(jié)合占優(yōu)勢［13-14］，故腫瘤患者外周血中CD8+細胞可能以Ts為主，Ts抑制了細胞及體液免疫功能。惡性腫瘤患者外周血中Th細胞減少，而Ts細胞增多，這一趨勢隨病情惡化而加重，是腫瘤患者細胞免疫功能低下的原因之一［15-16］。通過DC-CIK細胞治療，患者機體免疫力提高，Th/Ts比例增高，抗腫瘤作用增強，可以用上述理論進行解釋。但因納入樣本量較小，病種多元化，檢測的免疫指標較少，故上述結(jié)論及相關(guān)的免疫學(xué)機制仍需要在后續(xù)研究中進一步驗證和探索。

綜上所述，本研究提示自體DC-CIK回輸治療可一定程度上改善患者免疫系統(tǒng)功能，抑制腫瘤細胞生長，提高疾病控制率及患者生活質(zhì)量，且治療不良反應(yīng)較小，對既往多種治療方法療效不佳或無法耐受的晚期實體瘤患者可以嘗試。

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Clinical efficacy of autologous DC-CIK cells therapy for patients with advanced solid tumors

Ran Baoshi，Wang Wei，Wang Gang，et al
（Dept of Medical Oncology，Affiliated Anhui Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

Objective To study the influence of immune system and clinical efficacy of DC-CIK cells therapy for patients with advanced solid tumors.Methods Sixty patients were divided into two groups.The treatment group was received two cycles'reinfusion of DC-CIK cells，while the control group was not.The changes of proportional of immune cells and quality of life were compared before and after the treatment，and the clinical efficacy and adverse reactions were also detected.Results In the treatment group，the overall response rate was 0.00%，and the disease control rate was 36.67%.The ratios of CD4+T lymphocytes，NK and CIK cells were higher than before，but the ratio of CD8+T lymphocytes was less.Patients'overall quality of life was improved and the adverse reactions were fever，allergies etc.In the control group，the ratios of CD4+T lymphocytes，NK and CIK cells are less than before，but the ratio of CD8+T lymphocytes was higher.Patients'overall quality of life was decline.and the ratio of B lymphocytes in both groups didn't change significantly.Conclusion DC-CIK cells therapy can improvethe patients'with advanced solid tumors immune function and general situations，which has a certain clinical effect and its adverse reactions are less，so it can be used as one option for the patients who suffer the failures of chemotherapy and radiotherapy.

dendritic cells；cytokine-induced killer cells；advanced solid tumor；lymphocyte subsets；quality of life

R 730.51

A

1000-1492（2016）07-1053-06

2016-03-23接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81172172）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤化療科，合肥 230001

冉寶石，女，碩士研究生；季楚舒，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)生，責(zé)任作者，E-mail：jichushu@csco.org.cn