劉宗英，朱俊泰，金潔，李卓榮

·論著·

創(chuàng)新霉素前藥衍生物的合成及抗菌活性研究

劉宗英，朱俊泰，金潔，李卓榮

目的合成創(chuàng)新霉素前藥衍生物，測定其體外抗菌活性。

方法以創(chuàng)新霉素為起始原料，經(jīng)酯化或酰胺化反應得到目標化合物 1a ～ f 和 2a ～ f。

結果共合成 12 個創(chuàng)新霉素前藥衍生物，其結構均經(jīng)核磁共振氫譜和質(zhì)譜確證；化合物 1a ～ e 體現(xiàn)了較強的體外抗甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）、耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、甲氧西林敏感表葡菌（MSSE）、耐甲氧西林表葡菌（MRSE）和肺炎鏈球菌（ATCC49619）活性，其中化合物 1a、1e 體外抗 MSSA、MRSA、MSSE、MRSE、ATCC49619 活性是創(chuàng)新霉素的 4 ～ 128 倍，相當或略優(yōu)于陽性對照藥替甲環(huán)素。

結論在創(chuàng)新霉素的 C-2 羧酸上形成取代苯甲酰氧甲酯或環(huán)己基甲酰氧甲酯前藥有利于提高體外抗革蘭陽性菌活性，化合物 1a、1e 的體內(nèi)抗菌活性值得進一步研究。

化學技術，合成； 藥物前體；抗菌活性；創(chuàng)新霉素

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術， 2016， 11（4）：314-318

隨著抗生素的廣泛使用，一些菌株如革蘭陽性菌中的耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、耐青霉素肺炎鏈球菌（PRSP）和耐萬古霉素腸球菌（VRE），革蘭陰性菌中的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌開始出現(xiàn)多藥耐藥性。由于當前細菌耐藥形勢嚴峻，尤其超級耐藥性細菌的出現(xiàn)，使研發(fā)新的抗耐藥菌新藥迫在眉睫［1-4］。

創(chuàng)新霉素［5］是由山東濟南土壤中分離出的一株游動放線菌（Actinoplanes tsinanensis）發(fā)酵產(chǎn)生，是我國發(fā)現(xiàn)的第一個全新結構骨架抗生素。創(chuàng)新霉素具有中等抗菌譜，對部分革蘭陽性與陰性菌有抑制作用且毒性很低。小鼠體內(nèi)活性研究結果表明，創(chuàng)新霉素對金葡菌、痢疾桿菌和大腸桿菌感染的小鼠均具有較強的治療作用。創(chuàng)新霉素在臨床上對大腸桿菌引起的敗血癥、泌尿系統(tǒng)感染、腸道感染等有較好療效。由于創(chuàng)新霉素具有中等抗菌譜，影響其在臨床上的廣泛使用。本文以創(chuàng)新霉素為先導化合物，設計合成了一系列創(chuàng)新霉素前藥衍生物并測定其體外抗菌活性，以期發(fā)現(xiàn)抗菌活性增強，藥代動力學特性更優(yōu)的新型抗菌藥物。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器A400 多點接種儀為英國Denley 公司產(chǎn)品；MP 90 熔點儀為瑞士 Mettler Toledo 公司產(chǎn)品，溫度計未經(jīng)校正；Bruker 400 ultrashieldTM核磁儀為德國 Bruker 公司產(chǎn)品；70-SE 質(zhì)譜儀為英國 VG 公司產(chǎn)品。

1.1.2主要試劑體外測活所用創(chuàng)新霉素為自制（純度 ＞ 99.1%），其余試劑均為市售分析純或化學純。

1.2方法

1.2.1目標化合物的合成

1.2.1.1（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸酯的合成以創(chuàng)新霉素為起始原料，在三乙胺作用下與取代甲酸氯甲酯（5a ～ f）反應得到目標化合物 1a ～ f［6-7］。其中，起始原料創(chuàng)新霉素為微生物發(fā)酵產(chǎn)物；前藥修飾物 1a ～ f 制備中所需原料5a ～ f 的制備以取代甲酰氯為起始原料，在氯化鋅作用下與多聚甲醛發(fā)生酯化反應制得［8］（圖 1）。

1.2.1.2（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸酯/酰胺的合成以創(chuàng)新霉素為起始原料，在三乙胺作用下與取代醇或取代氨（6a ～ f）發(fā)生酯化或酰胺化反應得到目標化合物 2a ～ f［9］（圖 2）。

1.2.2體外抗菌活性采用美國國家臨床實驗室標準化委員會（NCCLs）推薦的平皿二倍稀釋法測定目標化合物 1a ～ f、2a ～ f 的最低抑菌濃度（MIC），陽性對照藥為創(chuàng)新霉素和替甲環(huán)素。于無菌平皿內(nèi)加入 1 ml 藥液，再加入融化的 50 ℃ MH培養(yǎng)基 14 ml，混勻，使其每皿內(nèi)所含藥物終濃度依次為 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg/L；待冷卻后用多點接種儀接種細菌，接種菌量約為 105CFU/ml。置于 35 ～37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h，觀察記錄結果，無菌生長的平皿中所含藥物最小的濃度即為最低抑菌濃度。測定菌株分別為甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）、耐甲氧西林金葡菌（MRSA）、甲氧西林敏感表葡菌（MSSE）、耐甲氧西林表葡菌（MRSE）、肺炎克雷伯菌（E+和 E-）、大腸埃希菌（E+和 E-，ATCC25922）、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）和肺炎鏈球菌（ATCC49619）。其中大腸埃希菌 E+和肺炎克雷伯菌 E+為產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶菌株。

圖1　化合物 1a ～ f 的合成路線Figure 1　Synthesis of compounds 1a - f

圖2　化合物 2a ～ f 的合成路線Figure 2　Synthesis of compounds 2a - f

2　結果

2.1目標化合物的合成

共合成 12 個創(chuàng)新霉素前藥衍生物，所有化合物的結構均經(jīng)過1H-NMR 和 MS 分析確證。

2.1.1（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（苯甲酰氧）甲酯（1a）淡黃色固體，收率 59%，mp：116 ～ 118 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.92（s，1H），7.95（d，J = 7.2 Hz，2H），7.21（t，J = 6.0 Hz，1H），7.57（t，J = 8.0 Hz，2H），7.17（d，J = 1.6 Hz，1H），7.12（d，J = 8.0 Hz，1H），6.99（d，J = 7.2 Hz，1H），6.77（d，J = 7.2 Hz，1H），6.02（d，J = 6.0 Hz，1H），5.92（d，J = 6.0 Hz，1H），4.42（d，J = 4.0 Hz，1H），3.2（m，1H），1.23（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：390.1 ［M+ Na］+。

2.1.2（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（4'-甲基苯甲酰氧）甲酯（1b）淡黃色固體，收率 52%，mp：140 ～ 143 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.92（s， 1H），7.84（d，J = 8.0 Hz，2H），7.37（d，J = 8.0 Hz，2H），7.16 （d，J = 1.6 Hz，1H），7.12（d，J = 8.0 Hz，1H），7.00（t，J = 7.6 Hz，1H），6.77（d，J = 7.2 Hz，1H），6.00（d，J = 6.0 Hz，1H），5.92（d，J = 6.0 Hz，1H），4.42（d，J = 3.6 Hz，1H），3.62（m，1H），2.40（s，3H），1.22（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：404.1 ［M+ Na］+。

2.1.3（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（4'-氟苯甲酰氧）甲酯（1c）淡黃色固體，收率 54%，mp：57 ～ 60 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.92（s，1H），7.99（d，J = 8.0 Hz，2H），7.38（d，J = 8.0 Hz，2H），7.16（s，1H），7.12（d，J = 8.0 Hz，1H），7.00（t，J = 8.0 Hz，1H），6.77（d，J = 7.2 Hz，1H），6.00（d，J = 6.0 Hz，1H），5.93（d，J = 6.0 Hz，1H），4.42（d，J = 3.6 Hz，1H），3.62（m，1H），1.24（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：408.1 ［M+ Na］+。

2.1.4（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（4'-甲氧基苯甲酰氧）甲酯（1d）淡黃色固體，收率 37%，mp：118 ～ 119 ℃。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ 10.92（s，1H），7.91（d，J = 8.8 Hz，2H），7.16（d，J = 1.6 Hz，1H），7.12 （d，J = 8.4 Hz，1H），7.08（d，J = 8.4 Hz，2H）7.00（t，J = 7.6 Hz，1H），6.77（d，J = 7.6 Hz，1H），5.98（d，J = 6.0 Hz，1H），5.91（d，J = 6.0 Hz，1H），4.42（d，J = 4.0 Hz，1H），3.85（s，3H）3.62 （m，1H），1.22（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：420.1 ［M+ Na］+。

2.1.5（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（環(huán)己基甲酰氧）甲酯（1e）淡黃色固體，收率 58%，mp：99 ～ 101 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.93（s，1H），7.18（s，1H）7.13 （d，J = 8.0 Hz，1H）7.00（t，J = 8.0 Hz，1H），6.79（d，J = 7.6 Hz，1H），5.73（d，J = 6.0 Hz，1H），5.68（d，J = 6.0 Hz，1H），4.35（d，J = 3.6 Hz，1H），3.59（m，1H），2.31（m，1H），1.79（m，2H），1.67（m，2H），1.57（m，1H），1.26 （m，8H）。MS（ESI+）m/z：396.1 ［M+ Na］+。

2.1.6（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-羧酸（金剛烷甲酰氧）甲酯（1f）淡黃色固體，收率 69%，mp：147 ～ 150 ℃。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ 10.93（s，1H），7.18（d，J = 1.2 Hz，1H），7.13（d，J = 8.0 Hz，1H），7.00（t，J = 7.6 Hz，1H），6.77（d，J = 7.2 Hz，1H），5.73（d，J = 5.6 Hz，1H），5.67（d，J = 5.6 Hz，1H），4.34（d，J = 4.0 Hz，1H），3.58（m，1H），1.97（s，3H），1.77（d，J = 2.4 Hz，6H），1.66（m，6H），1.27（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：448.2 ［M+ Na］+。

2.1.7（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（2'-嗎啉代）乙胺（2a）淡黃色固體，收率 63%，mp：203 ～ 205 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.88（s，1H），7.87（s，1H），7.15 （d，J = 2.0 Hz1H），7.09（d，J = 8.0 Hz，1H），6.99（t，J = 7.6 Hz，1H），6.76（d，J = 7.2 Hz，1H），4.10（d，J = 3.6 Hz，1H）3.59（m，1H），3.54（t，J = 4.4 Hz，4H），3.29（m，1H），3.11（m，1H），2.32（m，6H），1.21（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：346.2 ［M+ H］+。

2.1.8（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（2'-嗎啉代）乙酯（2b）淡黃色固體，收率 61%，mp：125 ～ 128 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.91（s，1H），7.17（d，J = 2.0 Hz，1H），7.11（d，J = 8.4 Hz，1H），7.00（t，J = 7.6 Hz，1H），6.78（d，J = 7.2 Hz，1H），4.29（d，J = 3.6 Hz，1H），4.12（m，2H），3.55（m，1H），3.52（m，4H），2.39（m，2H），2.31（m，4H），1.27（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：347.2 ［M+ H］+。

2.1.9（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（2'-二甲氨基）乙胺（2c）淡黃色固體，收率 78%，mp：209 ～ 212 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.87（s，1H），7.95（s，1H），7.14 （d，J = 2.0 Hz，1H），7.09（d，J = 8.0 Hz，1H），6.98（t，J = 7.6 Hz，1H），6.75（d，J = 7.2 Hz，1H），4.11（d，J = 3.2 Hz，1H），3.58（m，1H），3.22（m，1H），3.09（m，1H），2.26（t，J = 6.8 Hz，2H），2.10（d，J = 3.6 Hz，6H），1.19（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：304.1 ［M+ H］+。

2.1.10（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（3'-二甲氨基）丙胺（2d）淡黃色固體，收率 66%，mp：169 ～ 170 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.87（s，1H），8.08（t，J = 4.4 Hz，1H），7.14（d，J = 2.0 Hz，1H），7.08（d，J = 8.0 Hz，1H），6.98（t，J = 7.6 Hz，1H），6.75（d，J = 7.2 Hz，1H），4.11（d，J = 3.6 Hz，1H），3.59（m，1H），3.16（m，1H），3.03（m，1H），2.19（t，J = 7.2 Hz，2H），2.11（s，6H），1.53（m，2H），1.19（d，J =6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：318.2 ［M+ H］+。

2.1.11（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（3'-咪唑）丙胺（2e）淡黃色固體，收率 47%，mp：218 ～ 220 ℃。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.88（s，1H），8.19（t，J = 5.2 Hz，1H），7.60（s，1H），7.15（t，J = 5.2 Hz，2H），7.09（d，J = 8.0 Hz，1H），6.98（t，J = 8.0 Hz，1H），6.89（s，1H），6.76（d，J = 7.2 Hz，1H），4.14（d，J = 3.6 Hz，1H），3.96（t，J = 7.2 Hz，2H），3.63 （m，1H），3.09（m，1H），3.01（m，1H），1.84 （m，2H），1.19（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：341.1 ［M+ H］+。

2.1.12（2R，3S）-3-甲基-3，5-2H-噻喃［4，3，2-cd］吲哚-2-甲酰（3'-氧代吡咯烷）丙胺（2f）淡黃色固體，收率 56%，mp：183 ～ 184 ℃。1H-NMR （400 MHz，DMSO-d6）δ 10.87（s，1H），8.13（t， J = 5.2 Hz，1H），7.14（s，1H），7.08（d，J = 8.0 Hz，1H），6.98（t，J = 7.6 Hz，1H），6.75（d，J = 7.2 Hz，1H），4.12（d，J = 3.6 Hz，1H），3.61（m，1H），3.23（m，3H），3.06（m，1H），2.20（m，2H），1.92（m，2H），1.57（m，2H），1.18（d，J = 6.8 Hz，3H）。MS（ESI+）m/z：358.2 ［M+ H］+。

2.2體外抗菌活性

采用平皿二倍稀釋法測定了目標化合物體外抗菌活性，其最小抑菌濃度（MIC）結果如表 1 所示。研究結果表明化合物 1a ～ e 顯示了較強的體外抗 MSSA、MRSA、MSSE、MRSE 和 ATCC49619活性，MIC 值為 0.125 ～ 16 μg/ml；化合物 2b、2c、2f 顯示了較弱的抗 MSSA 活性（MIC 值為 4 ～64 μg/ml）；化合物 1a - f、2a - d、2f 顯示了較弱的抗銅綠假單胞菌活性（MIC 值為 16 ～ 64 μg/ml）。

表1　化合物 1a ～ f、2a ～ f 的體外最小抑菌濃度（μg/ml）Table 1　In vitro antibacterial activities of 1a - f， 2a - f （μg/ml）

3　討論

目標化合物體外抗菌活性結果表明化合物1a ～ e 體外抗 MSSA、MRSA、MSSE、MRSE 和ATCC49619 活性強于先導化合物創(chuàng)新霉素，其中化合物 1a、1e 體外抗 MSSA、MRSA、MSSE、MRSE、ATCC49619 活性是創(chuàng)新霉素的 4 ～ 128 倍，化合物 1a、1e 體外抗 MSSA、MRSA 活性是陽性對照藥替甲環(huán)素的 1 ～ 8 倍，化合物 1a、1e 體外抗 MSSE、MRSE 活性與替甲環(huán)素相當，表明在創(chuàng)新霉素的 C-2 羧酸上形成取代苯甲酰氧甲酯（1a ～d）或環(huán)己基甲酰氧甲酯（1e）前藥有利于提高創(chuàng)新霉素體外抗革蘭陽性菌活性；化合物 1b ～ d 的體外抗 MSSA、MRSA、MSSE、MRSE 和ATCC49619 活性較化合物 1a 下降了 2 ～ 32 倍，說明在 C-2 酯基的苯環(huán)上增加取代基團（甲基、氟、甲氧基）不利于抗菌活性提高；化合物 1a ～ f、2a ～ d、2f 體外抗銅綠假單胞菌活性與創(chuàng)新霉素相當，但弱于陽性對照藥替甲環(huán)素（MIC 值為8 μg/ml），說明在創(chuàng)新霉素的 C-2 羧酸上形成酯/酰胺前藥未能提高抗革蘭陰性菌活性?；衔?1a、1e 的體內(nèi)抗菌活性值得進一步研究。

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【Abstract】

ObjectiveTo synthesize and evaluate the in vitro antibacterial activities of Chuangxinmycin prodrugs.

MethodsCompounds 1a - f and 2a - f were synthesized via esterification or amidation of Chuangxinmycin.

ResultsThe structure of 12 Chuangxinmycin prodrugs synthesized in this paper was confirmed by1H-NMR and MS. Compounds 1a - 1e showed potent antibacterial activity against MSSA， MRSA， MSSE， MRSE and ATCC49619. The antibacterial activities of compounds 1a， 1e against MSSA， MRSA， MSSE， MRSE，ATCC49619 were 4 to 128-fold stronger than that of Chuangxinmycin，and similar to or stronger than that of Tigecycline.

ConclusionProdrugs with a C-2 carboxyl benzoyloxy methyl ester or cyclohexanecarboxyloyloxy methyl ester of Chuangxinmycin are favorable for increasing the in vitro antibacterial activities on Gram-positive bacteria. The in vivo antibacterial activities of compounds 1a and 1e deserve further investigation.

Author Affiliations： Center for Drug Evaluation， CFDA， Beijing 100038， China （LIU Zong-ying）；Department of Medicinal Chemistry， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China （LIU Zong-ying， ZHU Jun-tai， JIN Jie， LI Zhuo-rong）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol， 2016， 11（4）：314-318

Synthesis and antibacterial activity evaluation of Chuangxinmycin prodrugs

LIU Zong-ying， ZHU Jun-tai， JIN Jie， LI Zhuo-rong

Chemistry techniques， synthesis；Prodrugs；Antibacterial activity；Chuangxinmycin

LI Zhuo-rong， Email： l-z-r@263.net

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.04.005

國家自然科學基金（81373268）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2014ZX09507-009-04）

100038 北京，國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評中心（劉宗英）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所合成室（劉宗英、朱俊泰、金潔、李卓榮）

李卓榮，Email：l-z-r@263.net

2016-05-11