鄒有土

·質(zhì)量控制·

重組單克隆抗體的純化研究

鄒有土

重組單克隆抗體是新一代生物工程技術(shù)產(chǎn)品，其通過特定的靶點(diǎn)發(fā)揮藥效［1］。隨著大規(guī)模哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，工業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)液體積可達(dá) 1 萬升以上，抗體表達(dá)量可達(dá) 5 g/L 以上，極大地加重了重組單抗下游純化的壓力［2-3］，下游純化成為限制重組單抗工業(yè)化擴(kuò)大的主要因素［4-6］。重組單抗雜質(zhì)控制濃度指標(biāo)見表 1，這些指標(biāo)必須通過離心、過濾和色譜層析純化后控制在一定濃度以下［7-10］。重組抗體的純化一般可以分為細(xì)胞培養(yǎng)液澄清、抗體捕獲、抗體精制純化、病毒滅活和純化工藝的放大等流程。

表1　重組單抗雜質(zhì)控制濃度以及去除方法

1　細(xì)胞培養(yǎng)液澄清

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，在重組單抗分泌到培養(yǎng)液的同時(shí)，培養(yǎng)液中也含有大量的細(xì)胞顆粒、碎片、細(xì)胞器及細(xì)胞DNA［11］。工業(yè)化規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)液澄清通常由三個(gè)步驟完成，具體步驟見圖 1［12］。第一步處理通常設(shè)置為離心，培養(yǎng)液中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片通過離心去除后可大大減輕后續(xù)深層過濾或者微濾步驟的負(fù)荷。離心操作可分為批處理模式和連續(xù)流模式。批處理模式適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，而連續(xù)流模式可以處理更大的培養(yǎng)液體積，更適用于工業(yè)化規(guī)模。隨著低離心剪切力離心機(jī)的發(fā)展，離心、過濾的混合型離心機(jī)在細(xì)胞澄清步驟的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛［7］。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定的絮凝劑，可以使細(xì)胞懸浮物如細(xì)胞碎片等更易離心去除，進(jìn)一步改善細(xì)胞培養(yǎng)液的澄清度，減少深層過濾的步驟。而微濾在細(xì)胞培養(yǎng)液澄清中，其效果要好于離心機(jī)，且其成本較低，但微濾會(huì)擴(kuò)大料液體積 3 ～ 4 倍，導(dǎo)致后續(xù)純化負(fù)擔(dān)增加，不利于工業(yè)化生產(chǎn)［4］。

圖1　細(xì)胞培養(yǎng)液澄清三步驟

深層過濾和切向流過濾通常在澄清過程的第二步使用。對(duì)于大規(guī)模純化，深層過濾處理的體積相對(duì)比較小，而切向流過濾則具有更大的處理能力，并兼具濃縮的功能。但深層過濾使用方便、清潔、高效，在重組單抗的工業(yè)純化中應(yīng)用廣泛。深層過濾屬于非均相分離，能夠使料液通過整個(gè)多孔介質(zhì)而不僅僅是表面過濾，并且可以很好地防止下游層析柱的堵塞。在生物醫(yī)藥工業(yè)中，深層過濾器通常由纖維素或聚丙烯纖維組成的濾床以及硅藻土組成的支架構(gòu)成。深層過濾的主要目的是去除細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞碎片、部分色素、細(xì)胞器等物質(zhì)，可以在過濾固體含量比較小的懸浮體中使用，也可以在固體含量比較大的情況下使用。在深層過濾中增加排阻和電吸附作用，則能更有效地截留污染物［4］。澄清的最后一步是 0.22 μm 的膜過濾，能有效地去除固體顆粒和細(xì)菌，有報(bào)道指出在深層過濾器末端增加 0.22 μm 的過濾膜，能減少澄清過濾的操作步驟［13］。

2　抗體捕獲

捕獲的目的是濃縮和獲得高純度的蛋白，這個(gè)步驟通常使用離子交換或親和層析法。離子交換的原理是基于蛋白質(zhì)分子的表面電荷和色譜基質(zhì)上相反電荷的基團(tuán)之間的相互作用。結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白質(zhì)可以通過改變 pH 或者鹽濃度進(jìn)行分離。離子交換是最常用的分離和純化蛋白質(zhì)的色譜技術(shù)，其具有高容量、長(zhǎng)壽命、低成本等特點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單、易于控制，但其通常只能將蛋白純化至中等純度。親和層析是根據(jù)蛋白與配基之間的可逆的特異性作用進(jìn)行抗體的捕獲，高特異性是其主要特征。使用親和層析一步純化不僅可以得到有針對(duì)性的高收益抗體，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液中的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA 等物質(zhì)可以大量的去除，且多種抗體類型都能找到其相應(yīng)的親和填料［3］。

隨著層析介質(zhì)載量和重復(fù)利用性能的不斷優(yōu)化，目前親和層析已經(jīng)成為重組單抗純化的首要選擇［14-15］。最成功的例子就是用 Protein A 捕獲單克隆抗體，該法具有很多的優(yōu)點(diǎn)［15］：①特異性好，一步純化所得抗體的純度大于 95%；②具有濃縮的作用，洗脫液的抗體濃度高于 10 g/L，大大減少了后續(xù)純化溶液處理體積；③低 pH 洗脫并孵育，可以有效滅活病毒；④適用于所有人源的（除 IgG3）抗體和Fc 融合蛋白。但同時(shí)也存在一定的局限性：①Protein A 凝膠價(jià)格昂貴，比普通色譜介質(zhì)的價(jià)格高數(shù)倍；②低 pH 條件下洗脫，抗體分子容易形成聚集體和沉淀；③Protein A 配基脫落，需在后續(xù)純化中去除。可以采用以下策略解決上述問題：①適當(dāng)提高抗體洗脫緩沖液的 pH 值，更有利于重組單抗的穩(wěn)定；②在洗脫緩沖液中加入一些蛋白穩(wěn)定劑，如精氨酸、尿素等，能夠有效抑制聚集體的形成；③在低溫條件下進(jìn)行層析操作，也可降低重組單抗的聚集。

親和層析介質(zhì)非常多，以下幾種親和層析介質(zhì)在重組單抗的純化中有廣泛的應(yīng)用，其中 Protein A 是從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的一種蛋白質(zhì)，它能夠特異性地與哺乳動(dòng)物 IgG 的 Fc 區(qū)域結(jié)合；Protein G 是從 G 類鏈球菌中分離出來的胞壁蛋白，能與 IgG Fc 區(qū)域相結(jié)合。天然的Protein G 和血漿中的白蛋白有親和力，因此通過基因工程重組的 Protein G 去掉了白蛋白的親和位點(diǎn)；Protein L 對(duì)不同的 IgG、IgM、IgA、IgE 以及 IgD 都有親和力。輕鏈的Kappa 區(qū)域可以和 Protein L 結(jié)合，但是和 lambda 區(qū)域沒有親和作用，純化方法建立之前，需要鑒定抗體的類型，以便選擇正確的層析填料來分離純化。不同抗體類型在選擇親和層析介質(zhì)上面也有差異：①嵌合抗體、人源化抗體可以選擇 Protein A 或者 Protein G 親和填料；②Fc 融合蛋白選擇 Protein A 層析填料；③Fab 片段或 scFv 單鏈選擇Protein L；④單區(qū)域抗體 sdAb 通常有 VH 區(qū)域，可以使用 Protein A 作為捕獲步驟。

3　抗體精制純化

雖然親和層析可以快速去除大量雜質(zhì)，但很難將這些雜質(zhì)去除到規(guī)定濃度以下，后續(xù)可以采用精制色譜方法，如陽(yáng)離子交換層析（CEX）、陰離子交換層析（AEX）、疏水作用層析（HIC）等，來去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、高分子聚合物、DNA、內(nèi)毒素和脫落的親和配基等雜質(zhì)［16-17］。

陽(yáng)離子交換層析通常采用吸附-洗脫模式，主要的目的在于去除 DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、脫落的親和配基和內(nèi)毒素。在洗脫過程中，雜質(zhì)與陽(yáng)離子介質(zhì)結(jié)合力弱而被除去，而重組單抗則吸附在填料上，再通過改變 pH 或者增加鹽離子濃度將目的蛋白洗脫下來。陰離子交換層析一般采用流穿模式進(jìn)行純化，去除殘留的 DNA、內(nèi)毒素及聚合物。在流穿模式中，用脫鹽或者稀釋的方式將溶液的鹽離子濃度調(diào)低，使重組單抗流穿而微量雜質(zhì)保留在柱子上，以此達(dá)到去除內(nèi)毒素和 DNA 的目的。陰離子交換層析有處理量大、動(dòng)態(tài)載量高、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，適合最后精制步驟除去痕量雜質(zhì)。疏水作用層析是采用高鹽上樣，低鹽洗脫模式，通過強(qiáng)離子濃度變化進(jìn)行目的蛋白與雜質(zhì)之間的分離，能有效除去宿主細(xì)胞蛋白、DNA 和病毒等雜質(zhì)。

通常情況下，會(huì)選用兩步柱層析作為精細(xì)純化步驟，一方面是為了獲得高純度的樣品，一方面是保證足夠高的產(chǎn)品得率。AEX 和 HIC 通常采用流穿模式，這是因?yàn)閱慰沟牡入婞c(diǎn)通常比較高，而且這種模式具有比結(jié)合-洗脫模式更高的載量。然后將流穿的樣品再用 CEX 進(jìn)行純化，CEX 可采用梯度洗脫模式，使單抗樣品的純度達(dá)到最大值。

4　病毒滅活

在抗體純化過程中除了要考慮回收率和純度外，還需考慮如何有效地滅活清除病毒，F(xiàn)DA Q5A 指導(dǎo)性文件要求使用額外的兩個(gè)不同步驟來去除病毒，以確保實(shí)現(xiàn)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品的安全性［10］。

不同類型的病毒清除有不同的方法，其中加熱和輻射清除病毒是最有效的，但這些方法在重組單抗等生物制品中不適用。低 pH 孵育是重組單抗純化中最常用的病毒滅活方法，通過將 Protein A 洗脫液的 pH 調(diào)節(jié)至低于 3.8 并孵育一定時(shí)間，可以有效地去除脂質(zhì)包膜病毒［18］。但是將重組單抗溶液調(diào)至低 pH 容易導(dǎo)致重組單抗失活及聚集。經(jīng)研究表明，在溶液中加入 0.3 ～ 2 mol/L 的精氨酸，可以達(dá)到穩(wěn)定重組單抗及減少聚集的作用。還有一些重組單抗溶液在中和 pH 的過程中，會(huì)產(chǎn)生渾濁沉淀，但沉淀中不一定含有重組單抗，在這種情況下，可用 0.45 μm 或者 0.22 μm的濾膜過濾去除沉淀，也可用深層過濾的方法來去除這些沉淀。另外，非包膜病毒如鼠細(xì)小病毒由于具有較高的化學(xué)溶液耐受性，必須采用物理的方法來去除，其中吸附法和小孔徑膜過濾法均被廣泛應(yīng)用。病毒過濾既可以采用切向流過濾，也可以采用盲端過濾，但采用切向流過濾往往導(dǎo)致樣品濃度過低，因此盲端過濾法更為合適。病毒過濾器分為過濾逆轉(zhuǎn)錄病毒級(jí)別（＜ 50 nm）和過濾細(xì)小病毒級(jí)別（＜ 20 nm）。病毒過濾的步驟可以設(shè)計(jì)在精制過程中的任意步驟之后，通常在恒定的壓力下進(jìn)行。由于病毒過濾器的孔徑特別小，尤其是細(xì)小病毒級(jí)別的過濾器，在樣品含有聚集體情況下很容易造成堵塞，必須增加過濾的操作壓力來解決這一問題。

5　純化工藝放大

目前細(xì)胞的培養(yǎng)規(guī)模越來越大，從 12 000 ～ 15 000 L到在建的 20 000 L 細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模，同時(shí)多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)罐并行運(yùn)行。這些極大地推動(dòng)了大規(guī)模蛋白質(zhì)純化技術(shù)的發(fā)展：從批產(chǎn)幾公斤，年產(chǎn)幾十公斤重組單抗發(fā)展到批產(chǎn)幾十公斤，年產(chǎn)上十噸的規(guī)模。同時(shí)，新型凝膠技術(shù)、更大規(guī)模的純化生產(chǎn)系統(tǒng)技術(shù)和膜過濾技術(shù)的發(fā)展，縮短了重組單抗純化時(shí)間，進(jìn)一步節(jié)約了投資，提高了產(chǎn)能和產(chǎn)率。目前商品化的 Protein A 填料在線性流速大于 500 cm/h，結(jié)合時(shí)間小于 2.4 min 的條件下，動(dòng)態(tài)載量高達(dá) 38 mg/ml。離子交換工業(yè)層析柱在直徑 60 cm、柱高 30 cm 的情況下線性流速可高達(dá) 500 cm/h。這些純化技術(shù)的發(fā)展不僅有利于工藝放大后大規(guī)模層析柱的填裝，還大大提高了生產(chǎn)效率，縮短操作時(shí)間，能夠有效避免抗體分子產(chǎn)生各種變體和聚集體。

治療所需的高品質(zhì)重組單抗需要高效的上游和下游的制造流程。當(dāng)生物反應(yīng)器從搖瓶放大到試生產(chǎn)規(guī)模，下游工藝也必須按比例增加［4， 19］。純化工藝放大通常包括兩個(gè)步驟：第一步從實(shí)驗(yàn)室到中試規(guī)模增加 50 ～ 100 倍，第二步從試生產(chǎn)規(guī)模到全生產(chǎn)規(guī)模增加 10 ～ 50 倍。下游工藝的放大不僅是單純?cè)黾哟笮『蛯?shí)驗(yàn)室設(shè)備的體積，大規(guī)模純化過程中使用的管道尺寸變大、過濾器變大、泵類型不同、死體積增大均會(huì)導(dǎo)致純化放大出現(xiàn)困難［20］。且不同的親和填料應(yīng)進(jìn)行篩選以實(shí)現(xiàn)高的生產(chǎn)速率，同時(shí)必須具有高的動(dòng)態(tài)結(jié)合載量并能夠在低反壓下工作。柱體積根據(jù)所需結(jié)合能力必須計(jì)算出最佳柱床高度、流速和動(dòng)態(tài)能力。停留時(shí)間等于該柱床的高度除以流體的線速度，線速度必須保持恒定。運(yùn)行流量不應(yīng)該超過最大流量的 70%。按比例放大之前，需選擇那些壽命長(zhǎng)，一致性好，穩(wěn)定的層析填料［21］。比例放大時(shí)，柱體積應(yīng)保持柱床高度的恒定而只增加柱徑，每單位填料的蛋白質(zhì)載量應(yīng)該是相同的，線性流動(dòng)速度也應(yīng)該相同［22］。

目前主要使用的常規(guī)色譜層析方法在工藝放大方面具有較高的限制，當(dāng)前重組單抗純化的下游處理能力已不能滿足細(xì)胞培養(yǎng)液體積快速提高的需求，同一批細(xì)胞培養(yǎng)液往往需要通過多次色譜純化才能完成。工藝放大的瓶頸突出表現(xiàn)在緩沖液及純化中間體的儲(chǔ)罐大小有限，還有層析柱直徑超過 2 m 后常常出現(xiàn)液流分配問題和裝柱問題。近年來出現(xiàn)了一些如選擇性沉淀或高選擇性液液分離的非色譜純化技術(shù)，以及模擬移動(dòng)床色譜、雙水相萃取、膜色譜等各方面技術(shù)，處理能力可達(dá) 10 kg/L 以上，大幅度提高了單次樣品的處理量。這些新技術(shù)的出現(xiàn)，將彌補(bǔ)常規(guī)色譜技術(shù)處理量方面的不足。

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2016-04-28