張　楠,葛　晶,周子謙,尹　雋,鐘　江

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系,上海 200438)

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AcMNPVbro基因的表達(dá)和作用研究

張楠,葛晶,周子謙,尹雋,鐘江

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系,上海 200438)

bro基因(baculovirusrepeatedorf)是桿狀病毒編碼的一個獨(dú)特的基因家族,一些病毒的基因組中編碼有多個該基因家族的成員.研究分析了苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)基因組僅有的一個bro基因，結(jié)果表明： AcMNPVbro基因(ac-bro)在感染后 6h 就開始轉(zhuǎn)錄,并在8h時檢測到BRO表達(dá)；ac-bro基因敲除的重組病毒感染后子代病毒的效價略低于野生型病毒,且其DNA復(fù)制明顯推遲.利用大腸桿菌中重組表達(dá)的Ac-BRO蛋白進(jìn)行的體外實驗提示其具有結(jié)合DNA的能力.這些結(jié)果提示ac-bro基因在病毒的復(fù)制中有一定的作用.

桿狀病毒；bro基因家族； DNA結(jié)合； 基因敲除

桿狀病毒是感染昆蟲的大型雙鏈 DNA病毒,其代表種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifonicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)基因組約134kb,編碼154個基因[1].bro(baculovirusrepeatedorf)是桿狀病毒特有的一個基因家族[2],不少病毒都編碼了多個bro基因,例如OpMNPV,BmNPV,LdNPV,XcGV分別編碼了3個,5個,16個和7個bro[3-6].但也有些病毒中并不編碼該基因家族的成員,如PxGV,AfMNPV和RoMNPV[7-9].

桿狀病毒編碼的BRO蛋白的大小從88個氨基酸到450個氨基酸不等,但它們N端的80～150個氨基酸(Bro-N)保守性較強(qiáng),都帶有核酸結(jié)合域[10-11].雖然該基因分布廣泛,但其功能尚無明確結(jié)論.有研究提示該蛋白可能利用CRM1介導(dǎo)的核運(yùn)輸通道進(jìn)行蛋白質(zhì)的運(yùn)輸[12].也有研究表明,有些BRO蛋白可能在病毒感染抑制宿主mRNA轉(zhuǎn)譯方面有一定的作用[13].AcMNPV僅編碼一個bro基因(orf2,這里稱為ac-bro),目前對其功能所知甚少.本研究分析了ac-bro基因的表達(dá)和潛在的功能,提出其表達(dá)產(chǎn)生的BRO蛋白具有結(jié)合DNA的活性,在病毒復(fù)制中具有一定的作用.

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和病毒

Spodopterafrugiperda細(xì)胞株Sf9用TMN-FH培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich)添加10%胎牛血清和 100U/mL 青霉素、100μg/mL鏈霉素后培養(yǎng).細(xì)胞轉(zhuǎn)染用Cellfectin試劑(Invitrogen)進(jìn)行.vAcGFP是一株表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)的重組桿狀病毒AcMNPV,系由多角體蛋白基因啟動子表達(dá)egfp基因,利用Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen)構(gòu)建[14].ac-bro基因敲除的重組病毒vAcGFPΔBRO的構(gòu)建見后.病毒效價用終點(diǎn)稀釋法在96孔板中進(jìn)行.

1.2Ac-BRO蛋白的原核表達(dá)

ac-bro的基因序列通過PCR擴(kuò)增,引物為Ac-bro1-up和Ac-bro1-down(表1).PCR產(chǎn)物(651bp)回收后,用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切,并克隆到pET-28a(+)(Novagen),保持ac-bro的讀碼框與載體上N-端6×His讀碼框一致,得到pET-Ac-bro,并經(jīng)酶切和測序驗證正確.用pET-Ac-bro轉(zhuǎn)化的E.coliBL21 (DE3)進(jìn)行Ac-BRO蛋白的表達(dá).1L菌液在搖床中培養(yǎng)3h后,加入0.8mmol/L IPTG,在16℃下繼續(xù)培養(yǎng)14h.菌體4000r/min離心,沉淀懸浮于適量20mmol/L Tris,pH 7.4,300mmol/L NaCl,10mmol/L咪唑(pH 7.4)中,用超聲裂解菌體.重組Ac-BRO蛋白帶有6×His標(biāo)簽,可以結(jié)合到Ni2+-NTA柱(Novagen)上,并通過梯度濃度的咪唑溶液洗脫純化.Ac-BRO蛋白在250mmol/L時洗脫下來.蛋白溶液用Centripreps(Amicon,10kD)脫鹽和濃縮.

表1　本研究所用PCR引物序列

1.3ac-bro基因在感染細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

從AcGFP感染的Sf9細(xì)胞和對照Sf9細(xì)胞中提取中RNA,用TRIzol Max RNA Isolation Kit (Invitrogen) 進(jìn)行,并用RevertAid M-MuLV transcriptase (Fermentas)進(jìn)行cDNA的合成.用Ac-bro2-up和Ac-bro2-down(表1)進(jìn)行PCR檢測.

1.4抗體制備和Western blot

用純化的Ac-BRO蛋白根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法免疫小鼠,獲得抗血清.免疫組化檢測Ac-BRO蛋白時[15],用AcGFP感染Sf9細(xì)胞,不同時間后收集,進(jìn)行SDS-PAGE(12%)和Western blot.分別用所制備的抗血清(1∶500稀釋)和堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(Sigma-Aldrich, 1∶30000稀釋)作為第一和第二抗體檢測Ac-BRO的表達(dá).

1.5Ac-bro敲除的重組桿狀病毒的構(gòu)建

病毒基因組中ac-bro上下游的臨近區(qū)域分別用P1/P2,以及P3/P4兩對引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物先后克隆到pUC18載體,在上下游序列之間帶有一個BamHⅠ位點(diǎn).在該位點(diǎn)處插入阿普拉霉素(Apramycin)抗性基因片段,得到pBroFLK-Apra.該質(zhì)粒通過PCR,酶切和DNA序列分析等方法驗證正確.包括上下游以及抗性基因的片段用P1/P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所得到的DNA片段用于電轉(zhuǎn)化帶有AcGFP基因組(BacGFP)的E.coliRecA+菌株BJ5183-BacGFP.電轉(zhuǎn)化用BioRad電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行,條件設(shè)為2.5kV,25μF及200Ω.用帶有50μg/mL 卡那霉素,7μg/mL 慶大霉素和40μg/mL 阿普拉霉素的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌,并從陽性克隆中提取Bacmid DNA,經(jīng)PCR驗證正確,命名為BacGFPΔBro.用該Bacmid DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,得到ac-bro敲除的重組病毒vAcGFPΔBro.

1.6病毒基因組DNA的Real-time PCR定量

Sf9細(xì)胞在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),并以vAcGFP和AcGFPDBro感染(10pfu/cell).在感染后不同時間收集細(xì)胞,用PBS漂洗一次后, 懸浮于500μL 裂解緩沖液(10mmol/L pH 8.0 Tris,10mmol/L EDTA, 0.25% SDS),50℃ 處理1h.用酚氯仿法抽提細(xì)胞內(nèi)總DNA,用DNA SYBR-Green 試劑盒(TOYOTB)進(jìn)行病毒基因組DNA的Real-time PCR定量檢測.所用引物為ORF2fw/ORF2rv(表1).

1.7Ac-BRO蛋白與DNA的結(jié)合

此實驗中所有水均用Milli-Q水(Millipore).重組表達(dá)的Ac-BRO蛋白(350μmol/L)經(jīng)2倍系列稀釋后,與DNA片段共同在室溫下孵育20min,孵育混合液(12μL)的組成為: 結(jié)合緩沖液(100mmol/L Tris,500mmol/L KCl,10 mmol/L DTT,pH 7.5),NP40,10mmol/L MgCl2,Ac-BRO或BSA和DNA(0.15pmol/L).所用DNA為一段24 nt的單鏈寡核苷酸(表1,EMSAoligo1).孵育后混合液用低離子強(qiáng)度的非變性聚丙烯酰胺凝膠(15%)進(jìn)行電泳,電泳緩沖液為TBE (25 mmol/L Tris,20mmol/L硼酸，0.25mmol/L EDTA).電泳在200V,4℃下進(jìn)行4h.隨后,凝膠分別用10%乙醇和0.7%硝酸固定 10min和6min,再用0.2% AgNO3染色5min.用Milli-Q 水清洗一次(2min)后,用3.0% NaOH和0.1%甲醛顯色約5min.

2　結(jié)　果

2.1ac-bro在感染細(xì)胞中的表達(dá)分析

RT-PCR結(jié)果表明,病毒感染后6h,ac-bro基因就開始轉(zhuǎn)錄,直到48h均可以檢測到其mRNA(圖1(a)),表明ac-bro基因在感染的早期就得到轉(zhuǎn)錄.用所制備的抗Ac-BRO抗血清進(jìn)行感染細(xì)胞總蛋白的Western blot分析,結(jié)果表明感染后8h就能檢測到Ac-BRO蛋白(圖1(b)),隨后蛋白水平有所上升,直到感染后期有所下降.

2.2ac-bro敲除病毒vAcGFPDBro的構(gòu)建和分析

用同源重組的方法構(gòu)建了ac-bro敲除的重組桿狀病毒病毒vAcGFPΔBro(圖2(a)).用PCR驗證了重組病毒的正確性(圖2(b)).用P1/P4引物進(jìn)行PCR,AcGFP和野生型AcMNPV均得到2.1kb的產(chǎn)物,而vAcGFPΔBro得到了2.5kb的產(chǎn)物,與預(yù)期一致；用位于插入的阿普拉霉素抗性基因內(nèi)部的引物P5與P1進(jìn)行PCR,得到0.75kb的產(chǎn)物,也證明了vAcGFPΔBro中已經(jīng)敲除了ac-bro(圖2(b)).

分別用vAcGFP和vAcGFPΔBro感染Sf9細(xì)胞(5pfu/cell),測定感染后不同時間點(diǎn)培養(yǎng)液中病毒的效價,結(jié)果見圖3.vAcGFPΔBro的病毒產(chǎn)量略低于vAcGFP.提取感染細(xì)胞的總DNA,用Real-time PCR檢測了DNA復(fù)制的動態(tài).從圖4中可見,vAcGFPΔBro病毒DNA水平的上升較晚,但同樣,到最后,vAcGFPΔBro與vAcGFP都達(dá)到了相似的DNA水平.

2.3Ac-BRO蛋白與DNA結(jié)合能力的分析

Ac-BRO蛋白的N端帶有潛在的單鏈DNA結(jié)合域.用銀染EMSA方法對其結(jié)合DNA的能力進(jìn)行了分析.如圖5所示,重組Ac-BRO蛋白系列稀釋后,與一段24nt的寡核苷酸(表1,EMSAoligo1)孵育后,導(dǎo)致該寡核苷酸的電泳遷移率發(fā)生變化,而小牛血清白蛋白對寡核苷酸的電泳情況沒有影響.

3　討　論

bro基因是桿狀病毒眾多基因中非常獨(dú)特的成員,不同的病毒有不同的拷貝數(shù),從零到十幾個不等.與bro序列相關(guān)的基因在一些痘病毒和噬菌體等中也有發(fā)現(xiàn)[10,16-17].在所有bro基因中,家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的bro基因研究最多,已經(jīng)知道所有這5個bro基因都在感染的早期得到轉(zhuǎn)錄和翻譯[2],而其中3個BRO蛋白,BRO-A,C,D,是核蛋白,具有核酸結(jié)合能力[18].研究提示這些BRO蛋白可能是利用CRM1介導(dǎo)的核輸出通道的核-質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12],而BRO-A, C, D 3個BRO蛋白N端的富含亮氨酸的序列具有核輸出信號的作用.BmNPV BRO-B和BRO-E蛋白可以和宿主BmTRN-1相互作用,抑制某些mRNA的轉(zhuǎn)譯[13].也有的BRO蛋白則能和層粘連蛋白相互作用[19],具體功能還不清楚.

ac-bro是AcMNPV編碼的唯一的bro家族基因,共編碼328a.a.其基因序列與BmNPVbro-d最接近.Ac-BRO其N端1～80為bro-N基序,此外在188～252區(qū)域還有1個未知功能的保守基序(DUF3627),在昆蟲痘病毒、昆蟲虹彩病毒及變形蟲Mimivirus等中也有發(fā)現(xiàn).本研究的結(jié)果提示,盡管ac-bro上游帶有晚期啟動子的特征序列(ATAAG),但事實上它在感染后很早就得到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯,且持續(xù)較長時間,這與BmNPVbro基因,尤其是bro-d基因相似.而ac-bro與BmNPVbro-d的序列同源性也高達(dá)80.2%.本研究還顯示,Ac-BRO蛋白具有結(jié)合單鏈寡核苷酸的能力.這種結(jié)合是非特異性的,因為用不同的寡核苷酸甚至雙鏈DNA也得到類似的結(jié)果(結(jié)果未顯示).敲除ac-bro對病毒的DNA復(fù)制有明顯的影響,盡管對子代病毒產(chǎn)量的影響較小. 這些結(jié)果提示雖然ac-bro并非病毒復(fù)制所必須,但它在病毒的復(fù)制中仍然具有相當(dāng)?shù)淖饔?對病毒DNA合成的作用尤為明顯.但其究竟是通過何種機(jī)制發(fā)揮這種作用的,則還有待進(jìn)一步的研究揭示.

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Expression and Function of AcMNPV bro Gene

ZHANG Nan, GE Jing, ZHOU Ziqian, YIN Juan, ZHONG Jiang

(Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Unlike some baculoviruses that encode multiplebro(baculovirusrepeatedorfs) family genes, AcMNPV contains only onebrogene (ac-bro). Here, we show thatac-browas transcribed and translated in the early stage of virus infection. A mutant AcMNPV with deletion inac-browas generated and exhibited slightly decreased virus titer compared to wild type virus, while the viral DNA replication was significantly delayed. Ac-BRO was expressed inE.coliand the purified Ac-BRO can bind oligonucleotide. These results suggested that Ac-BRO played a role in AcMNPV replication in the cells.

baculovirus; bro; DNA binding; gene knockout

0427-7104(2016)01-0128-05

2015-04-24

國家自然科學(xué)基金(31170143)

張楠(1989—),碩士研究生；鐘江,男,教授,通訊聯(lián)系人,E-mail: jzhong@fudan.edu.cn.

Q 786

A