白　豆，龍　玲，朱乃碩,3

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；3. 復(fù)旦大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200438)

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一株產(chǎn)1-脫氧野尻霉素(DNJ)枯草芽孢桿菌黑色變種的誘變育種研究

白豆1,2，龍玲1,2，朱乃碩1,2,3

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系，上海 200438；2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；3. 復(fù)旦大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200438)

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin, DNJ)是一種哌啶生物堿，是α-葡萄糖苷酶的強(qiáng)抑制劑，具有降低餐后血糖、抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗病毒等作用.目前工業(yè)生產(chǎn)的DNJ主要是從桑葉中提取的，價(jià)格昂貴.為了獲得DNJ的穩(wěn)定高產(chǎn)菌株，本文通過(guò)對(duì)產(chǎn)DNJ枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger)分別采用紫外線誘變、亞硝基胍誘變和60Coγ射線誘變方法，得到發(fā)酵培養(yǎng)液DNJ表達(dá)量達(dá)20.7mg/L的菌株，其表達(dá)量較初始菌株產(chǎn)量提高了27.7%，并對(duì)細(xì)菌的DNJ合成代謝相關(guān)基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序，菌株命名為B-231.

1-脫氧野尻霉素； 枯草芽孢桿菌黑色變種； 誘變育種

1-脫氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin, DNJ)是一種哌啶生物堿，化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶.是一種存在于植物、微生物及蠶體中[1-3]的天然糖類似物，自然界以桑樹(shù)中含量最高，也可通過(guò)化學(xué)合成或半合成方法得到[4]，為強(qiáng)效的糖代謝酶抑制劑(比如α-葡萄糖苷酶、己糖激酶、葡萄糖醛酸酶和糖原磷酸酶等)，可顯著延緩多糖的降解過(guò)程，降低餐后血糖的峰值，穩(wěn)定空腹血糖[5].并且，還有減肥及增加胰島敏感性、抗病毒、抗腫瘤轉(zhuǎn)移[6-8]等作用，在醫(yī)藥和保健品有廣泛的應(yīng)用.此外，DNJ也可用于食品領(lǐng)域，以桑葉為原料的食品，作為功能性降糖的產(chǎn)品在日本等東亞國(guó)家已經(jīng)允許在市場(chǎng)上銷售[9]，顯示出DNJ在保健食品領(lǐng)域的廣闊前景.

目前，醫(yī)藥上所用的DNJ基本上都是從桑葉提取的，一方面天然產(chǎn)物中DNJ含量較低，另一方面，DNJ的分離純化較為復(fù)雜,再加上提取過(guò)程中的損失，產(chǎn)量很低.而人工DNJ合成難度較大，成本高，不適于大規(guī)模的生產(chǎn).故目前DNJ商品價(jià)格十分昂貴，含量20%的粗提物售價(jià)即可高達(dá)2000元/kg.而微生物生產(chǎn)DNJ方面，僅限于產(chǎn)DNJ菌株的篩選與鑒定，沒(méi)有開(kāi)展大規(guī)模微生物發(fā)酵制備DNJ方面的報(bào)道.鑒于微生物發(fā)酵生產(chǎn)DNJ具有投資小、見(jiàn)效快、方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，故可通過(guò)微生物大規(guī)模發(fā)酵實(shí)現(xiàn)DNJ的大規(guī)模生產(chǎn).

枯草芽孢桿菌黑色變種(Bacillussubtilisvar.niger)菌株是本實(shí)驗(yàn)保存的一株生產(chǎn)DNJ的菌株，經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中的DNJ濃度為16.2mg/L.該菌株是野生型菌株，發(fā)酵產(chǎn)物含量較低，還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，本文分別采用紫外線誘變、以亞硝基胍(NTG)為誘變劑的化學(xué)誘變和60Coγ射線誘變技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌黑色變種進(jìn)行誘變處理，以期獲得DNJ穩(wěn)定高產(chǎn)的菌株.

1　材料與方法

1.1菌種、試劑與儀器

枯草芽孢桿菌黑色變種Bacillussubtilisvar.niger(FSCC115051)，本實(shí)驗(yàn)室保存；1-脫氧野尻霉素(DNJ)，上海世峰生物科技有限公司;芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)，J&K Chemical；乙腈(色譜純)，Sigma公司；α-葡萄糖苷酶溶液，0.8%的大鼠小腸丙酮粉溶解于0.1mol/L的PBS(pH 6.8)中，離心，取上清備用；對(duì)硝基苯酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，1.25mmol/L；其余試劑為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水.高效液相色譜儀Ultimate3000，美國(guó)戴安公司，色譜柱為Phenomenex luna C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，檢測(cè)器為DIONEX RF-3000紫外檢測(cè)器；熒光多功能酶標(biāo)儀Spectrum M5，Molecular Device公司等.

1.2方法

1.2.1發(fā)酵液中DNJ的含量的檢測(cè)

用α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)間接半定量檢測(cè)細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ的含量，并且可以對(duì)誘變后的細(xì)菌進(jìn)行大批量的初步篩選.將DNJ標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.002，0.004，0.008，0.016，0.032，0.064，0.128mg/mL的7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度，參考Kyung等[10]的方法，在96孔板中依次加入緩沖液PBS、底物對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷pNPG、待檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)液上清/DNJ、α-葡萄糖苷酶溶液，總體積200μL，置于隔水式恒溫培養(yǎng)箱中，37℃反應(yīng)1h，最后加入終止液Na2CO3，終止反應(yīng).后把96孔板置于熒光多功能酶標(biāo)儀中，在405nm處掃描其吸光度.根據(jù)公式如下公式，計(jì)算抑制率：

1.2.2RT-HPLC測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ的含量

取DNJ標(biāo)準(zhǔn)液(濃度為0.0025，0.005，0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32mg/mL)和菌液各50μL于1.5mL的EP管中,加入0.4mol/L的K3BO3(pH 8.5)20μL,再加入5mmol/L的衍生化試劑FMOC-Cl(溶解于50%乙腈中)50μL，立即混勻.25℃恒溫干式金屬浴中反應(yīng)25min,再加體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液800μL,反應(yīng)液經(jīng)過(guò)0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行色譜分析，流動(dòng)相為乙腈∶0.1%醋酸(體積比=11∶16)，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量100μL.

1.2.3存活率與致死率計(jì)算

存活率與致死率的計(jì)算采用如下公式：

存活率=0.1mL誘變后菌液中的活菌數(shù)÷0.1mL對(duì)照菌液中的活菌數(shù)；

死亡率=(0.1mL對(duì)照菌液中的活菌數(shù)-0.1mL誘變后菌液中的活菌數(shù))/0.1mL對(duì)照菌液中的活菌數(shù).

1.3誘變

1.3.1紫外線誘變

取2次5mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以3000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩均勻，調(diào)整懸液的濃度為108CFU/mL.將原液稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-64個(gè)濃度，每個(gè)濃度取5mL稀釋液于直為9cm的平皿中，放入一無(wú)菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處，然后開(kāi)啟皿蓋正式在攪拌下照射0.5，1，2，3，5min，操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光.取未經(jīng)紫外線燈照射的菌液為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次.

1.3.2亞硝基胍誘變

在用紫外線誘變處理枯草芽孢桿菌黑色變種的基礎(chǔ)上，通過(guò)pNPG法初步篩選表現(xiàn)出較高α-糖苷酶抑制能力的菌株，然后采用亞硝基胍進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘變.取10mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以6000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入0.1mol/L磷酸緩沖液9mL，振蕩均勻，調(diào)整懸液的濃度為108/mL.吸取NTG母液1mL，然后用pH 6.0磷酸緩沖液配制母液，使母液濃度為1mg/mL，將菌懸液和NTG母液進(jìn)行混合，使混合液中亞硝基胍的濃度分別問(wèn)為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4mg/mL.接著將混合液放在搖床上，在37℃，100r/min中處理30min，菌懸液4℃離心，用冷的無(wú)菌水洗滌3次以終止誘變.再加入相同體積的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)2h，度過(guò)生理延時(shí)期.

1.3.360Coγ射線輻射誘變

在用紫外線誘變處理枯草芽孢桿菌黑色變種的基礎(chǔ)上，通過(guò)pNPG法初步篩選表現(xiàn)出較高α-糖苷酶抑制能力的菌株，然后采用60Coγ射線進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌進(jìn)行誘變.取10mL發(fā)酵液于10mL離心管中，以6000r/min 4℃離心10min，棄去上清液.加入生理鹽水9mL，振蕩洗滌3次，離心10min，棄去上清液.加入無(wú)菌水9mL，振蕩均勻，調(diào)整懸液的濃度為107/mL.將原液稀釋,取10-3、10-4、10-5、10-64個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別吸取1mL于1.5mL EP管中.采用60Co產(chǎn)生的γ射線進(jìn)行誘變處理.輻射源為第二軍醫(yī)大學(xué)輻射中心的60Co源裝置，在相同的輻射劑量率20Gy/min下，分別采用100，200，400，600，800，1000，1500，2000Gy 12個(gè)劑量.

1.4DNJ合成相關(guān)基因擴(kuò)增與序列分析

Kang等[11]報(bào)道了BacillussubtilisMORI 3K-85中與1-脫氧野尻霉素合成有關(guān)的基因GabT1，Yktc1，GutB1分別編碼轉(zhuǎn)氨酶、磷酸酶和氧化還原酶.本實(shí)驗(yàn)以參考Myung等[12]的方法分別合成引物及進(jìn)行基因擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1.以菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上進(jìn)行Blast比對(duì).

表1　DNJ合成相關(guān)基因GabT1，Yktc1，GutB1引物

2　結(jié)果與討論

2.1pNPG法測(cè)定1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品

以DNJ濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做a-糖苷酶方法檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.如圖1所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0945x+0.918其線性回歸系數(shù)R2=0.9929，線性關(guān)系良好.

2.2RT-HPLC法測(cè)定細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ含量

反向高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(RT-HPLC)分別測(cè)定DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度40mg/mL)和枯草芽孢桿菌黑色變種出發(fā)菌株發(fā)酵液中DNJ的含量，在吸收?qǐng)D譜中，圖2(a)為DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在第7.94min和16.70min處出峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH；圖2(b)為細(xì)菌發(fā)酵液，在第8.01min和16.86min處出峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH.檢測(cè)誘變前細(xì)菌發(fā)酵液中的DNJ含量為16.2mg/L.

2.3紫外線的誘變效應(yīng)

取標(biāo)記好序號(hào)的未照射的制備菌液和照射菌液各0.1mL均勻涂布，37℃暗箱培養(yǎng)24h,計(jì)數(shù)活菌數(shù).在未照射對(duì)照組，濃度為10-3的菌液的平板成片無(wú)法計(jì)數(shù)，而10-6的菌液的平板菌落太少，故選擇10-5、10-4兩個(gè)濃度梯度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).

2.3.1死亡率的計(jì)算

以10-4稀釋和10-5稀釋的菌液進(jìn)行的紫外誘變結(jié)果如下表，隨著紫外照射時(shí)間的延長(zhǎng)致死率也在不斷的提高，到5min時(shí)，死亡率已達(dá)到100%，為了得到較滿意的誘變效果，我們選擇致死率約80%，90%兩個(gè)照射時(shí)間的菌株.

表2　不同時(shí)間紫外線照射處理后枯草芽孢桿菌黑色變種的死亡率

(1) 10-4稀釋菌液，(2) 10-5稀釋菌液.

2.3.2紫外線誘變后細(xì)菌生產(chǎn)DNJ能力鑒定

我們從菌懸液濃度分別為10-4、10-5的，誘變時(shí)間各為2min、3min的平板上各挑選24個(gè)單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對(duì)菌株生產(chǎn)DNJ的能力進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)紫外線誘變的菌株中其中有3個(gè)菌株表現(xiàn)出較大的的α-葡萄糖苷酶抑制能力，其抑制率分別為33.9%、34.7%、34.9%，其他的誘變菌株抑制α糖苷酶效果不明顯，還有出現(xiàn)一些負(fù)突變的菌株(數(shù)據(jù)未附上).對(duì)產(chǎn)DNJ菌株的具體的產(chǎn)能進(jìn)行計(jì)算，細(xì)菌上清液中的DNJ含量分別為17.4mg/L、17.9mg/L、18.1mg/L，平均值為17.8mg/L.

2.4亞硝基胍誘變效應(yīng)

2.4.1死亡率的計(jì)算

亞硝基胍處理后，不同劑量的亞硝基胍處理后菌株的存活率如表3(見(jiàn)第108頁(yè))所示，亞硝基胍的致死率相當(dāng)高，從菌株死亡率來(lái)看，亞硝基胍誘變的死亡率非常高，濃度為0.05mL/mL時(shí)死亡率已達(dá)到75.4%，0.03mL/mL 時(shí)死亡率已到達(dá)98.8%.

表3　不同劑量的亞硝基胍處理后枯草芽孢桿菌的死亡率

2.4.2亞硝基胍誘變后細(xì)菌生產(chǎn)DNJ能力鑒定

參照文獻(xiàn)，我們從誘變劑量為0.2mg/mL，91.4%致死率平板上各挑選24個(gè)單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對(duì)菌株生產(chǎn)DNJ的能力進(jìn)行了鑒定.亞硝基胍誘變的菌株中有其中2個(gè)菌株的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為35.1%、35.4%.細(xì)菌上清液中的DNJ含量分別為18.3mg/L、18.5mg/L.其余突變菌株抑制α糖苷酶效果沒(méi)有明顯增加(數(shù)據(jù)未附上).

2.560Coγ射線輻射誘變

2.5.1死亡率的計(jì)算

60Coγ射線輻射誘變后，10-4稀釋度菌株的致死率，如表4所示，從菌株死亡率來(lái)看，當(dāng)誘變劑量為100Gy時(shí)，致死率為10.5%，隨著誘變劑量的增大，死亡率也不斷上升，到1000Gy時(shí)，死亡率已達(dá)88.3%.

表4　不同劑量60Coγ射線輻射誘變后枯草芽孢桿菌黑色變種的死亡率

2.5.260Coγ射線輻射誘變后細(xì)菌產(chǎn)DNJ能力鑒定

我們從誘變劑量為20Gy/min，致死率為87.4%的平板上各挑選24個(gè)單菌落分別置于有3mL LB液體12孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)60h.按照1.2的方法，對(duì)60Coγ射線輻射誘變后菌株生產(chǎn)DNJ的能力進(jìn)行了鑒定.其中有2個(gè)菌株的α-葡萄糖苷酶抑制率分別為39.4%、40.0%，其余菌株抑制α糖苷酶效果沒(méi)有明顯增加(數(shù)據(jù)未附上).細(xì)菌上清液中的DNJ含量分別為20.5mg/L、20.7mg/L.如圖3所示，檢測(cè)出的DNJ含量為20.7mg/mL，在第8.063min和第16.893min出的峰分別為FMOC-DNJ和FMOC-OH.

2.6DNJ合成相關(guān)基因擴(kuò)增與結(jié)果序列分析

對(duì)細(xì)菌上清液中DNJ含量為20.7mg/L的菌株中DNJ合成相關(guān)基因GabT1(約1270bp)、Yktc1(約950bp)以及GutB1(約1020bp)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示.

所測(cè)得基因序列在GenBank比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌黑色變種B-231中基因GabT1、Yktc1和GutB1經(jīng)過(guò)Blast比對(duì)之后，發(fā)現(xiàn)和細(xì)菌B.amyloliquefaciensFZB42(NC_009725.1)[10]的基因分別有83%，76%，76%的相似度，圖5分別是對(duì)枯草芽孢桿菌黑色變種B-231的基因GabT1、Yktc1和GutB1進(jìn)行推斷得出的氨基酸序列和細(xì)菌B.amyloliquefaciensFZB42對(duì)應(yīng)基因的氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果.

3　結(jié)　論

3.1檢測(cè)方法的問(wèn)題

本實(shí)驗(yàn)確定了用對(duì)硝基苯酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)為底物、通過(guò)測(cè)定α-葡萄糖苷酶活力狀況，從而間接檢測(cè)溶液中DNJ含量的半定量方法，在DNJ含量為0.002mg/mL，即可檢出.此方法方便操作，準(zhǔn)確性高，價(jià)格相對(duì)低廉，適合實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模誘變篩選時(shí)使用.pNPG法初步篩選到表現(xiàn)出較高的抑制α-葡萄糖苷酶活力的菌株，然后用RT-HPLC法進(jìn)一步對(duì)細(xì)菌發(fā)酵液中的DNJ定量檢測(cè).反向高效液相色譜法靈敏度更高，能特異性檢測(cè)DNJ.

3.2各種誘變技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)比較

在微生物發(fā)酵工業(yè)中，菌種通過(guò)誘變育種不僅可以提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量，改善生物學(xué)特性，而且對(duì)于研究有效產(chǎn)物的代謝途徑、遺傳圖譜繪制等方面都有一定的作用.目前工業(yè)生產(chǎn)上所使用的菌種，幾乎都是經(jīng)過(guò)誘變育種獲得的菌株.本室采用了紫外線誘變、亞硝基胍誘變和60Coγ射線誘變的方法.不同誘變劑處理枯草芽孢桿菌黑色變種菌株的結(jié)果表明，不同的誘變劑對(duì)該菌株有不同的致死效應(yīng)并且有累積效應(yīng).為進(jìn)一步的優(yōu)化誘變條件提供了較為詳盡的數(shù)據(jù).其中60Coγ射線誘變的方法獲得一株高產(chǎn)菌株細(xì)菌發(fā)酵液中DNJ的含量比出發(fā)菌株提高了27%，平均產(chǎn)量達(dá)到20.6mg/L.

3.3DNJ合成相關(guān)基因

1-脫氧野尻霉素是多基因合成的菌體次生代謝產(chǎn)物，在鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬中均有發(fā)現(xiàn)，然而其代謝通路研究的并不十分透徹.本室篩選到的枯草芽孢桿菌黑色變種B-231表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶活力，在分析其DNJ合成相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)中，從而為該菌株產(chǎn)生DNJ提供了遺傳數(shù)據(jù)基礎(chǔ).本室后續(xù)實(shí)驗(yàn)將對(duì)DNJ合成相關(guān)的3個(gè)基因進(jìn)行研究，為進(jìn)一步提高其產(chǎn)DNJ的能力提供了思路.

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Mutation Breeding of a Isolated Bacillus subtilis var.niger for Producing the 1-Deoxynojirimycin

BAI Dou1,2, LONG Ling1,2, ZHU Naishuo1,2,3

(1. Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences, Fudan University,Shanghai200438,China； 2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China； 3.InstituteofBiomedicalScience,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

1-Deoxynojirimycin(DNJ) is a kind of alkaloid, known to improve diabetic conditions by inhibiting the activity ofα-glucosidase. It also plays a role in anti-tumor metastasis and antiviral activity. DNJ has been mainly isolated from the root and leaf of the mulberry tree(Morusalba) at present. However, it leads high cost. To obtain stable and high yield DNJ producing strain, in the current studyBacillussubtilisvar.nigerwhich can produce DNJ was treated with UV mutagenesis, nitrosoguanidine and60Coγ, a strain was isolated and named as B-231 finally. It produced 20.7mg/L DNJ in the fermentation broth, and the content of DNJ increased by 27.7% compared with the initial strain. More research was done on the new strain about its character in molecular biology. The genes associated with anabolism of DNJ were cloned and sequenced.

1-Deoxynojirimycin;Bacillussubtilisvar.niger; mutation breeding

0427-7104(2016)01-0104-08

2015-03-26

白豆(1985—)，女，碩士研究生；龍玲(1990—)，女，碩士研究生，此作者為共同第一作者；朱乃碩，男，教授，通訊聯(lián)系人，E-mail： nzhu@fudan.edu.cn.

Q 93-3

A