陳　歡， 林　芳， 楊振華， 徐文微， 王　東， 劉東春△， 唐　星

(1. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 2. 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 3. 藥學(xué)院， 遼寧 沈陽 110016)

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水飛薊賓·熊去氧膽酸蒸發(fā)共沉淀物對CCl4致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用*

陳歡1， 林芳2， 楊振華1， 徐文微1， 王東1， 劉東春1△， 唐星3

(1. 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 2. 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院， 3. 藥學(xué)院， 遼寧 沈陽 110016)

目的：研究水飛薊賓·熊去氧膽酸蒸發(fā)共沉淀物(SUE)對小鼠CCl4致急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：健康昆明種雄性小鼠80只，隨機(jī)分為8組(n=10)：空白組及模型組分別經(jīng)口投予羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，其余60只采用CCl4腹腔注射建立小鼠急性肝損傷模型，分別給予水飛薊賓(SLB，20 mg/kg)、熊去氧膽酸(UDCA，16.25 mg/kg)、SLB與UDCA等摩爾物理混合物(PM，36.25 mg/kg)和高中低劑量SUE(以SLB計(jì)10、20、40 mg/kg)治療，采用單因素方差分析肝體比變化，多功能酶標(biāo)儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。結(jié)果：與空白組相比，模型組肝體比有顯著性升高(P<0.05)，血清中AST和ALT水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比SLB、PM、SUE組血清AST、ALT顯示有不同程度的下降(P<0.05)，但UDCA組無顯著性差異；與SLB和PM相比，SUE能明顯降低小鼠血清ALT、AST含量(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：SUE對CCl4所致小鼠急性肝損傷有較好的保護(hù)作用，說明LB與UDCA制備成共沉淀物后，可更好的發(fā)揮協(xié)同作用，提高聯(lián)合應(yīng)用的藥效。

水飛薊賓；熊去氧膽酸；共沉淀物；四氯化碳；保肝；小鼠

水飛薊賓(silybin，SLB)是從菊科植物水飛薊(SilybummarianumL. Gaertn)的種子中提取分離得到的一對兒黃酮木脂素類化合物，被廣泛應(yīng)用于治療肝炎、肝硬化和毒性肝損傷等疾病，其保肝機(jī)制為抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、抗纖維化、細(xì)胞膜穩(wěn)定作用和調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生能力等[1-3]。但是SLB為一種難溶性的細(xì)小晶體，生物利用度不高，影響其藥效的發(fā)揮。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是中藥熊膽的有效成分，是一種非細(xì)胞毒性的膽汁酸，臨床主要用于治療慢性肝炎和原發(fā)性膽汁淤積性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎等各種膽汁淤積性肝病[4,5]。有臨床試驗(yàn)表明，SLB和UDCA聯(lián)合應(yīng)用治療非酒精性脂肪肝較單用SLB有較好療效[6]，將SLB和UDCA制備成蒸發(fā)共沉淀物(silybin-ursodeoxycholic acid evaporated coprecipitate，SUE)，可以提高SLB的體外溶出及生物利用度[7]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SUE的肝臟保護(hù)作用，本研究采用CCl4制造小鼠急性肝損傷模型，觀察SUE對實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

Synergy HT 型多功能酶標(biāo)儀(BioTek基因有限公司)，J2-HS型低溫離心機(jī)(Beckman公司)，JJ500型電子天平(常熟市雙節(jié)測試儀器廠)。SLB原料藥(遼寧盤錦華成制藥有限公司，批號20130301)，UDCA原料藥(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號20100510)，SLB與UDCA等摩爾物理混合物(Physical Mixture, PM)，SUE(自制，批號20140311)，CCl4(分析純，批號20140223，天津博迪化工有限公司)，門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)(批號20141212、20141215，南京建成生物工程研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法及動物分組

SUE的制備[7]：將等摩爾的SLB與UDCA完全溶解于適量的無水乙醇，然后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑至干，必要時(shí)進(jìn)一步減壓干燥至無醇味，粉碎過80目篩即得。

取健康昆明種雄性小鼠80只，由沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：211002300004781。隨機(jī)分為8組(n=10)，給藥組分別灌胃給藥SLB(20 mg/kg)，UDCA(16.25 mg/kg)，PM(以SLB計(jì)為20 mg/kg)，SUE(以SLB計(jì)為10、20、40 mg/kg，SUE-10，SUE-20，SUE-40)，灌胃藥物用0.3%(w/w)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)混懸均勻，配制相應(yīng)濃度，按20 mg/kg藥液體積灌胃，空白組和模型組均灌胃給予相應(yīng)體積的0.3%的CMC-Na水溶液，每日1次，連續(xù)2 d，第2次給藥(即實(shí)驗(yàn)開始后24 h)0.5 h后，除空白組外，其他各組分別腹腔注射0.2% CCl4大豆油溶液，空白組腹腔注射大豆油，注射體積為10 ml/kg，5 h后第三次給藥，同時(shí)禁食不禁水。末次給藥11 h后各組小鼠稱重，摘眼球取血，分離血清冰盒保存待測；并解剖小鼠，分離完整肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸干后稱量肝臟重量并記錄。

1.3小鼠體重變化和肝體比計(jì)算

將小鼠實(shí)驗(yàn)期間體重變化作圖，比較各組小鼠體重變化差異； 根據(jù)末次體重和小鼠肝臟重量計(jì)算肝體比(肝臟重量/體重)。

1.4AST和ALT指標(biāo)檢測

血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)含量的測定按照試劑盒說明書操作，采用多功能酶標(biāo)儀檢測。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1對小鼠體重和肝體比的影響

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體重未見明顯差異。與空白組相比，模型組動物肝體比顯著升高(P<0.05)，提示肝臟因?yàn)镃Cl4毒性導(dǎo)致急性炎癥性腫大；與模型組相比，其余各組肝體比無顯著性變化(圖1)。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio; SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate

*P<0.05vscontrol group

2.2對小鼠血清中AST及ALT的影響

與control組相比，model組中血清AST與ALT水平均顯著升高(P<0.01)。與model組相比，UDCA組AST與ALT都沒有顯著性變化，SLB組和PM組僅AST水平顯著性降低(P<0.05)，ALT水平?jīng)]有顯著性變化；SUE各劑量組AST和ALT水平有顯著性降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，其中以高劑量作用最為明顯。與SLB組相比，PM組AST和ALT水平無顯著性差異；SUE中、高劑量組血清的AST與ALT水平均顯著性降低(P<0.05，P<0.01)；SUE低劑量組(10 mg/kg)的ALT水平顯著低于SLB組(20 mg/kg)(P<0.01)；與PM組相比，SUE-40組AST和ALT水平顯著性降低(P<0.05)；SUE-20組ALT水平有顯著性降低(P<0.05)，AST水平有降低趨勢，但無顯著性差異(圖2)。

3　討論

各組小鼠實(shí)驗(yàn)期間體重未見明顯差異，原因可能是實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，小鼠體重差異未完全顯現(xiàn)；另外取血前各組小鼠體重均有下降趨勢，原因是末次給藥后小鼠禁食，導(dǎo)致體重略微下降[8]。

通過對各組小鼠肝體比進(jìn)行比較，model組小鼠較空白組小鼠肝體比顯著性升高，原因是CCl4毒性刺激使小鼠肝臟細(xì)胞腫脹變性導(dǎo)致小鼠肝重增加，提示造模成功[9]。而各給藥治療組與model組相比，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，可能與實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，各受試藥物未能完全逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷有關(guān)。

SLB：Silybin； UDCA：Ursodeoxycholic acid； PM：Physical mixture of SLB and UDCA with equimolar ratio； SUE：SLB·UDCA evaporated coprecipitate； AST：Aspartate aminotransferase； ALT：Alanine aminotransferase

**P<0.01vscontrol group;?#P<0.05,?##P<0.01vsmodel group;?△P<0.05,△△P<0.01vsSLB group;?▲▲P<0.01vsPM group

CCl4肝損傷模型是研究化學(xué)性肝損傷的經(jīng)典模型。CCl4進(jìn)入機(jī)體后，經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活，生成三氯甲基自由基(CCl3)和三氯甲基過氧自由基(OOCCl3)，這兩種自由基導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化或壞死，引起細(xì)胞膜通透性改變和線粒體損傷，引起肝細(xì)胞的各種變化導(dǎo)致肝損傷，致使正常分布在肝組織內(nèi)的AST和ALT滲漏，主要表現(xiàn)為血清中轉(zhuǎn)氨酶活性增加[10-14]。SLB是一種抗氧自由基活性物質(zhì)，其能減少CCl4的代謝激活生成的自由基并對這些自由基有清除作用，有研究證明，SLB能使CCl4對脂質(zhì)的共價(jià)結(jié)合明顯減少[13,14]。

本研究結(jié)果表明，SLB以及PM與model組相比表現(xiàn)出血清中AST水平下降，但對血清中ALT活性沒有明顯作用，原因可能是該給藥劑量的SLB對ALT活性的降低作用不如對AST敏感，有類似研究也顯示出相同結(jié)果[10]；而UDCA對AST和ALT活性降低作用不顯著，可能是因?yàn)閁DCA自身缺少還原基團(tuán)，UDCA體內(nèi)抗氧化作用可以通過增加肝細(xì)胞中谷胱甘肽和含硫醇蛋白的水平等作用實(shí)現(xiàn)的，機(jī)制復(fù)雜且緩慢，而在本試驗(yàn)時(shí)間較短所以未表現(xiàn)出降低血清中轉(zhuǎn)氨酶的作用[15-17]。與SLB組相比，PM組在降低血清中AST和ALT活性方面沒有顯著性差異，因而提示僅通過簡單物理混合使用SLB和UDCA不能很好的發(fā)揮二者的協(xié)同作用。

SUE組與SLB組相比可顯著改善CCl4致小鼠肝臟損傷，甚至較低劑量的SUE-10降酶水平也好于SLB單獨(dú)給藥；此外，SUE-40和SUE-20組與PM組比較，顯著降低血清AST和ALT水平，表現(xiàn)出較好的保肝效果，推測主要是因?yàn)閷LB與UDCA制備成共沉淀物后可顯著加快SLB的溶出速率，提高其在機(jī)體內(nèi)的生物利用度[7]，因此可以達(dá)到良好的保肝效果。UDCA是否能提高SLB對肝臟的靶向性，以及二者在作用靶點(diǎn)及通路上是否有保肝的協(xié)同作用有待進(jìn)一步深入研究。

總之，將SLB和UDCA制備成共沉淀物SUE，可顯著提高藥效，為SLB與UDCA的聯(lián)合用藥提供了一種新的制劑形式。

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silybin;ursodeoxycholic acid;coprecipitate;CCl4;hepatoprotective;mice

2015-04-27

2015-10-12

△Tel: 024-23984318; E-mail: liudongchun@outlook.com

R96

A

1000-6834(2016)01-038-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.010