劉紹東， 張彥秋， 曹　江

(西安石油大學(xué)體育系， 陜西西安 710065)

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有氧耐力訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體功能及PI3K-Akt蛋白的表達影響*

劉紹東， 張彥秋△， 曹江

(西安石油大學(xué)體育系， 陜西西安 710065)

目的：觀察有氧耐力訓(xùn)練大鼠骨骼肌線粒體磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路的表達情況。方法：將36只大鼠隨機分為3組(n=12)：對照組、有氧耐力訓(xùn)練組和一次性力竭組。分組干預(yù)結(jié)束后，檢測各組大鼠骨骼肌線粒體膜電位(MMP)水平、琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素C氧化酶(COX)活性，利用Western blot法測定組織中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB或Akt)的磷酸化水平。結(jié)果：與對照組相比，一次性力竭組大鼠MMP、SDH和COX活性水平、磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白水平明顯降低(P<0.05)；而有氧耐力訓(xùn)練組大鼠上述指標均顯著高于一次性力竭組(P<0.05)，與對照組比無明顯差異。結(jié)論：有氧耐力訓(xùn)練對大鼠骨骼肌線粒體具有保護作用，其機制可能與活化PI3K-Akt信號通路有關(guān)。

有氧耐力訓(xùn)練；大鼠；骨骼?。痪€粒體；PI3K-Akt信號通路

線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化和三磷酸腺苷合成的主要場所，因此也是機體完成各項生理活動所需能量的主要來源。骨骼肌細胞中含有豐富的線粒體，以滿足運動時骨骼肌收縮所需要的能量。骨骼肌細胞線粒體有氧代謝能力的高低直接影響機體耐力素質(zhì)的高低。目前研究已證實，規(guī)律開展的有氧耐力訓(xùn)練通過提高骨骼肌有氧代謝能力、肺組織有效氣體交換量、心臟射血能力和血紅蛋白攜氧能力等因素提升機體有氧耐力[1-3]。此外，動物實驗也證實，大鼠經(jīng)過8～12周有氧耐力訓(xùn)練后，其骨骼肌線粒體數(shù)目明顯增加，線粒體中SOD活性顯著升高，線粒體呼吸控制比也明顯增加[4,5]。

盡管線粒體在有氧耐力訓(xùn)練提升骨骼肌運動耐力中發(fā)揮如此重要的作用，但是有氧耐力訓(xùn)練發(fā)揮線粒體保護作用的具體機制仍未明確，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路作為經(jīng)典的存活通路是否參與其中也尚無研究證實。因此，本研究擬利用動物實驗檢測有氧耐力訓(xùn)練對一次力竭運動誘導(dǎo)骨骼肌線粒體功能異常的影響，以及該過程中PI3K-Akt信號通路的活化情況。

1　材料與方法

1.1材料

由西安交通大學(xué)實驗動物中心選購健康清潔級6周齡雄性SD大鼠36只(體重170～210 g)和相應(yīng)的飼料；BW-ZH-PT型動物跑臺購自上海軟隆科技發(fā)展有限公司；兔抗大鼠p-PI3K抗體和兔抗大鼠p-Akt抗體購自美國Cell signaling公司，兔抗大鼠β-actin抗體購自Santa Cruz公司；RIPA組織總蛋白提取試劑盒購自西安先鋒生物科技有限公司；常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2分組和干預(yù)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將所有大鼠隨機分為3組：對照組(Control)、有氧耐力訓(xùn)練組(ET)和一次性力竭組(NET)(n=12)。其中有氧耐力訓(xùn)練組在長0.6 m、寬0.4 m、深0.5 m的水池內(nèi)進行游泳運動，水池內(nèi)水溫穩(wěn)定在35℃左右，運動時間為每周5 d，每天運動時間逐周遞增，第一周，1 h/d；第二周，1.5 h/d；第3～8周，2 h/d，每周運動5 d。對照組和一次性力竭組不予任何處理。有氧耐力訓(xùn)練8 周結(jié)束后，有氧耐力訓(xùn)練組和一次性力竭組大鼠均進行一次持續(xù)下坡跑力竭運動，具體運動方法參考羅吉偉等人所用方法[6]。三級運動負荷分別為0°×8.2 m/min×15 min(相當于53% VO2max)、5°×15 m/min×15 min(相當于64% VO2max)、10°×19.3 m/min(相當于74%VO2max)持續(xù)至力竭，力竭判斷標準為大鼠停滯于跑到后1/3處達3次以上，聲、光、電等刺激無效。

1.3樣品采集和處理

干預(yù)結(jié)束時，立即斷頭處死各組大鼠，迅速取左后肢股四頭肌中間部分，用4℃磷酸鹽緩沖液沖洗干凈后用于提取總蛋白和線粒體?？偟鞍滋崛》椒ㄈ缦拢涸诒蠈⒐趋兰〗M織剪碎后，加入RIPA裂解液，于玻璃勻漿器中冰上勻漿15 min左右，將全部勻漿液快速轉(zhuǎn)移至離心管，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，即為總蛋白，保存于-80℃冰箱中備用。

1.4線粒體提取

采用動物組織/細胞活性線粒體分離試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，按照說明書操作步驟提取骨骼肌組織線粒體。將分離所得線粒體提取物保存于-80℃冰箱中備用。

1.5膜電位測定

將新鮮分離得到的骨骼肌組織線粒體用500 μl的JC-1工作液(碧云天生物技術(shù)有限公司)重懸，放入37℃水浴箱中孵育20 min，1 000 r/min離心20 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液充分洗滌2次，加入500 μl緩沖液重懸線粒體，于熒光酶標儀上檢測線粒體膜電位水平。分別以585 nm和514 nm波長的激發(fā)光激發(fā)熒光，記錄紅色、綠色熒光強度，兩者的比值即代表線粒體膜電位水平。

1.6酶活性測定

采用動物組織線粒體SDH活性檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)和線粒體COX活性測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，按照說明書操作步驟測定骨骼肌組織線粒體提取物中SDH和COX的活性。所有實驗均重復(fù)3次，樣本量均為5。

1.7Western blot

采用BCA法測定蛋白濃度，取等質(zhì)量的骨骼肌總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜，隨后用5%脫脂奶粉在室溫下封閉處理2 h，并分別用抗p-PI3K抗體(1∶500)、抗p-Akt抗體(1∶1 000)或β-actin單克隆抗體(1∶4 000)4℃孵育過夜，用含Tween-20的磷酸鹽緩沖液洗滌后，在室溫下加入生物素標記的山羊抗兔抗體室溫下孵育2 h，再次充分洗滌，用ECL法顯影，在Image-Pro Plus軟件中分析各蛋白條帶的積分吸光度值，以3次重復(fù)檢測所得平均值代表該組的目的蛋白表達水平，樣本量為5。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1大鼠骨骼肌線粒體功能檢測結(jié)果

與對照組相比，力竭運動后一次性力竭組大鼠骨骼肌MMP、線粒體SDH和COX活性均出現(xiàn)明顯的降低趨勢，而有氧耐力訓(xùn)練組的上述三個指標均顯著高于一次性力竭組(P<0.05，表1)，有氧耐力訓(xùn)練組和對照組無顯著性差異。

Tab. 1The mitochondrial function of rats skeletal muscle among groups

GroupMMPSDHCOXControl100±2.03100±2.29100±2.35NET81.1±2.11*76±1.88*70.4±2.30*ET94.2±2.16#95.5±1.41#86.3±2.76#

MMP：Muscle mitochondrial membrane； SDH：Succinate dehydrogenase； COX：Cytochrome coxidase； NET：Non-endurance training group； ET：Endurance training group

*P<0.05vscontrol group；?#P<0.05vsNET group

2.2大鼠骨骼肌PI3K-Akt信號通路活化狀態(tài)

與對照組相比，一次性力竭組大鼠骨骼肌組織中p-PI3K和p-Akt水平均明顯降低，而有氧耐力訓(xùn)練組上述蛋白水平均顯著高于一次性力竭組(P<0.05，圖1)。說明有氧耐力訓(xùn)練可以顯著改善大鼠抵抗一次力竭運動對PI3K-Akt信號通路活化的抑制作用。

Fig. 1Each group rats skeletal muscle PI3K - Akt signaling pathway related protein expression level

ET：Endurance training group； NET：Non-endurance training group

*P<0.05vscontrol group；?#P<0.05vsNET group

3　討論

有氧耐力訓(xùn)練可以有效改善骨骼肌線粒體功能和細胞整體代謝活性，但其中的具體機制尚未明確[7，8]。PI3K-Akt信號通路具有促進細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)物質(zhì)代謝的生物學(xué)作用，廣泛參與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和感染性疾病等的發(fā)生和發(fā)展過程[9-12]。近期Zhang等人在探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)心肌細胞線粒體功能時發(fā)現(xiàn)，毒胡蘿卜素在誘發(fā)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時，抑制了Akt磷酸化過程間接誘導(dǎo)線粒體損傷，而夾竹桃麻素則可通過持續(xù)活化PI3K-Akt信號通路部分消除毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放[13]。艾春雨等人也發(fā)現(xiàn)控制性低壓后處理活化PI3K-Akt信號通路參與其對抗兔缺血再灌注損傷脊髓線粒體結(jié)構(gòu)和功能的保護作用[14]。袁磊等人在探究1-磷酸鞘氨醇(S1P) 對缺氧/復(fù)氧乳鼠心肌細胞的保護作用及其分子機制中發(fā)現(xiàn)，S1P能夠顯著抑制缺氧/復(fù)氧引起的心肌細胞凋亡，其機制可能與S1P激活PI3K-Akt信號通路進而穩(wěn)定線粒體膜電位有關(guān)[15]。此外，進一步研究還發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt信號通路的下游分子糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β)的活化是該通路發(fā)揮保護線粒體結(jié)構(gòu)完整性的主要機制[16]。

本實驗利用大鼠游泳運動模擬有氧耐力訓(xùn)練，評價規(guī)律有氧耐力訓(xùn)練8周對機體抵抗一次力竭運動誘發(fā)線粒體損傷能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一次力竭運動可以造成骨骼肌線粒體膜電位和酶活性的降低，而持續(xù)8周的有氧耐力訓(xùn)練可以顯著提高大鼠抵抗一次力竭運動造成線粒體損傷的能力，說明活化PI3K-Akt信號通路可能是有氧耐力訓(xùn)練保護骨骼肌線粒體功能的主要機制之一。研究證實，PI3K誘導(dǎo)Akt磷酸化而活化后，可以通過真核細胞翻譯啟動子4E結(jié)合蛋白1促進線粒體呼吸鏈的活性升高[17]，還可以通過促進胰島素的促線粒體融合作用提高線粒體攝氧能力，還可能通過活化PI3K-Akt信號通路，誘導(dǎo)磷酸化的Akt向線粒體移位而發(fā)揮對線粒體乃至細胞整體的保護作用。Gautam等人發(fā)現(xiàn)IGF-1、胰島素和多種應(yīng)激因素均可迅速誘導(dǎo)Akt向線粒體移位和聚集，而且線粒體中聚集的Akt多數(shù)處于磷酸化的活化狀態(tài)，磷酸化的Akt進入線粒體是PI3K-Akt信號通路直接調(diào)節(jié)線粒體功能的重要機制[18,19]。結(jié)合本實驗結(jié)果，有氧耐力訓(xùn)練可能通過活化PI3K-Akt信號通路，繼而啟動上述機制發(fā)揮對骨骼肌線粒體的保護作用。

綜上所述，有氧耐力訓(xùn)練可能明顯提高機體抵抗一次力竭運動誘發(fā)線粒體損傷的能力，活化PI3K-Akt信號通路可能是有氧耐力訓(xùn)練保護骨骼肌線粒體功能的主要機制之一。

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The influence of the aerobic endurance training on the skeletal muscular mitochondria function and PI3K-Akt protein expression

LIU Shao-dong, ZHANG Yan-qiu△, CAO Jiang

(Physical Education Department of Xi’an Shiyou University, Xi’an 710065, China)

Objective: To determine the role of phosphatidylinositol 3-kinase - protein kinase B (PI3K-Akt) signaling pathway in the protective effect of aerobic endurance training on the skeletal muscular mitochondria. Methods: Thirty-six rats were randomly divided into three groups(n=12): control group, aerobic endurance training group and one-time exhaustive group. After the intervention，the quadriceps femoris muscle sample was obtained to detect the mitochondrial membrane potential(MMP), the activities of succinate dehydrogenase(SDH) and cytochrome coxidase(COX), and the protein levels of p-PI3K and p-Akt. Results: Compared with the control group, the levels of mitochondrial membrane potential, the activities of succinate dehydrogenase and cytochrome coxidase, and the protein levels of p-PI3K and p-Akt were all significantly decreased in the one-time exhaustive group(P<0.05). However, all the above was partially reversed in the endurance training group(P<0.05),and there was no obvious difference with the control group(P>0.05). Conclusion: Aerobic endurance training plays an important role in the protective effect on the skeletal muscular mitochondria, the mechanism may be related to activation PI3K-Akt signaling pathway.

aerobic endurance training;rat;skeletal muscle;mitochondria;PI3K-Akt signaling pathway

陜西省體育局常規(guī)課題基金資助項目(13044)

2015-01-30

2015-06-19

△Tel：15349218983； E-mail: zhangyq1115@163.com

G804.2

A

1000-6834(2016)01-055-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.05.014