高　園， 聶鴻靖， 楊　棟， 丁誠實(shí),2， 金　敏，諶志強(qiáng)， 邱志剛， 郭　旋， 陳照立Δ， 李君文Δ

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 2. 棗莊學(xué)院， 山東棗莊 277160)

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肝癌患者單個核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)與抗氧化能力的變化*

高園1， 聶鴻靖1， 楊棟1， 丁誠實(shí)1,2， 金敏1，諶志強(qiáng)1， 邱志剛1， 郭旋1， 陳照立1Δ， 李君文1Δ

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所， 天津 300050； 2. 棗莊學(xué)院， 山東棗莊 277160)

目的：探討肝癌患者單個核細(xì)胞(PBMC)線粒體DNA(mtDNA)拷貝數(shù)的變化及其與機(jī)體抗氧化能力的關(guān)系。方法：用FicollHypaque 離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，采用實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測線粒體NADH脫氫酶亞基1(ND1)基因的拷貝數(shù)，并以核基因組的β-actin作為內(nèi)參基因，比較25例肝癌患者與30例健康人外周血單個核細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)的差異。流式細(xì)胞術(shù)檢測單個核細(xì)胞活性氧(ROS)含量的變化。生化檢測法檢測血漿中總抗氧化能力(T-AOC)的變化。結(jié)果：肝癌組外周血單個核細(xì)胞ND1基因拷貝數(shù)是健康對照組的73%，表明肝癌患者外周血單個核細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)明顯下降。肝癌組單個核細(xì)胞活性氧含量的平均熒光強(qiáng)度為(417.82±110.62)，健康對照組為(301.82±75.54)，肝癌組單個核細(xì)胞活性氧含量顯著高于健康對照組(P<0.01)。肝癌組血漿總抗氧化能力(單位/毫升血漿)吸光度為(1.30±0.85)，健康對照組為(3.20±1.62)，肝癌組血漿總抗氧化能力顯著低于健康對照組(P<0.01)。結(jié)論：肝癌患者的外周血單個核細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)減少可能與機(jī)體抗氧化水平下降有關(guān)。

肝癌；線粒體DNA； 活性氧；總抗氧化能力；單個核細(xì)胞

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤[1]，在我國，肝癌是危害居民生命健康前3位最主要惡性腫瘤之一，我國肝癌具有發(fā)病率高、危害性大、病死率高等特點(diǎn)[2]。細(xì)胞免疫功能在肝癌患者抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)，肝癌患者細(xì)胞免疫功能受抑制，淋巴細(xì)胞是機(jī)體主要的免疫細(xì)胞，其必須有能量的供給才會有活性。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ATP的主要場所，在能量代謝、氧自由基生成及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起重要作用。ATP的產(chǎn)生主要依賴于呼吸鏈的完整性與氧化磷酸化功能的正常。線粒體DNA( mitochondrial DNA，mtDNA)是唯一存在于細(xì)胞器中且相對獨(dú)立的基因組，其在基因組中的個數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)。與核基因組相比，mtDNA沒有組蛋白保護(hù)，缺乏抗氧化機(jī)制和有效的修復(fù)系統(tǒng)，并且接近線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈，極易受周圍活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的損傷，當(dāng)ROS超過內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)的消除能力時，氧化/抗氧化失衡，會導(dǎo)致氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。在氧化應(yīng)激作用下，mtDNA拷貝數(shù)可能升高或降低[3]。mtDNA缺失后復(fù)制速度時常會發(fā)生變化，這可能正是造成線粒體功能失常的重要原因之一[4]。因此提高腫瘤患者體內(nèi)的抗氧化能力,減少自由基產(chǎn)生,對疾病的治療與預(yù)后均有很大幫助。近年來研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)變化與骨質(zhì)疏松、糖尿病、心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性[5-8]。目前，對惡性腫瘤中mtDNA突變的研究已經(jīng)成為一個快速發(fā)展的領(lǐng)域，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)幾乎在所有腫瘤中均存在mtDNA的突變，mtDNA突變的形式多種多樣。已有研究證實(shí)，mtDNA在胃癌組織中的拷貝數(shù)是下降的[9]。而對于肝癌患者血液細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的變化與體內(nèi)抗氧化能力變化的關(guān)系卻鮮有報道。

本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀和生化檢測法，檢測了肝癌患者單個核細(xì)胞中mtDNA的拷貝數(shù)、活性氧含量和血漿總抗氧化能力，旨在了解它們的變化情況，探討其變化在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用以及相互關(guān)系，為進(jìn)一步闡明線粒體功能異常與腫瘤的發(fā)生機(jī)制的關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與材料

人外周血淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll 1.077 g/ml)購自北京索萊寶公司；CM-H2DCFDA購自美國Life Technologies公司；總抗氧化能力(total-antoxidant capability，T-AOC)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；DNA提取試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；SYRB熒光定量試劑盒購自Applied Biology，引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

1.2研究對象

為2014年11月～2015年3月天津市腫瘤醫(yī)院初次住院肝癌患者血液25例，平均年齡(43.1±8.8)歲。對照組為同期中國人民解放軍第272醫(yī)院門診健康體檢人員血液30例，平均年齡(41.3±8.4)歲。樣本收集過程遵循“赫爾辛基”宣言,得到收集對象知情同意，采集靜脈血2 ml(EDTA抗凝)。

1.3儀器

流式細(xì)胞儀FACSCalibur購自美國BD公司。超級酶標(biāo)儀uQuant 200-999型購自美國伯騰(BioTek)儀器有限公司。實(shí)時熒光定量PCR儀7300型購自美國ABI公司。蛋白核酸測定儀Gene Quant 1300型購自美國GE公司。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)時熒光定量PCR檢測mtDNA的拷貝數(shù)取EDTA-K2抗凝血2 ml，用人外周血淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個核細(xì)胞，用TIANGEN公司血液/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA(包括mtDNA)。通過NADH脫氫酶亞基1(ND1)來確定mtDNA的數(shù)量，選用β-actin作為看家基因，ND1以及β-actin引物序列列于表中(表1)，實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μl：SYRB的PCR混合液(含dNTP，Mg2+，Taq酶，PCR緩沖液等)10 μl，滅菌水7 μl，模板DNA 2 μl，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μl。PCR擴(kuò)增條件為：先經(jīng)過95℃ 10 min預(yù)變性，再進(jìn)入95℃ 15 s，60℃ 1 min的40個循環(huán)，然后進(jìn)行融解曲線分析。分別計算內(nèi)參基因與待檢基因樣本的Ct均值差ΔCt(差值均一化)，求出肝癌組與健康對照組的ΔCt差值ΔΔCt，求值(2-ΔΔCt)得出肝癌組ND1基因與核β-actin基因拷貝量的變化比率。

Tab. 1　Sequence of primers of real-time PCR products

1.4.2細(xì)胞活性氧含量測定提取單個核細(xì)胞后，PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，DCFH-DA用DMSO溶解，用改良型RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至終濃度為10 μmol/L，細(xì)胞重懸于DCFH-DA探針中，37℃避光負(fù)載20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，陽性藥物組繼續(xù)加1～2 μl陽性藥物Rousp，繼續(xù)刺激細(xì)胞20 min，陽性藥物組與探針組PBS 洗2次，200目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長488 nm檢測，每個樣品收集10 000個細(xì)胞，Cell Quest軟件分析吸光度值。1.4.3提取血漿與總抗氧化能力分析EDTA-K2抗凝血5 000 r/min，離心5 min，吸取上層血漿，用南京建成公司T-AOC測定試劑盒于520 nm處測定吸光度值。血漿總抗氧化能力計算公式為：

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2．1肝癌患者單個核細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)變化

2.1.1單個核細(xì)胞基因組DNA提取結(jié)果所得DNA溶于TE緩沖液中，DNA樣本經(jīng)蛋白核酸蛋白分析儀檢測，每一例DNA的OD 260/280的比值均≥1.7，DNA純度較高符合實(shí)驗(yàn)要求?；蚪MDNA提取后進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示條帶清晰，僅含與預(yù)期目的片段大小一致的條帶，無其他產(chǎn)物出現(xiàn)，說明DNA純度較高，適合進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)(圖1)。

Fig. 1Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

M：λ-Hind Ⅲ digest DNA mark； 1：Healthy control group； 2：Hepatocellular carcinoma(HCC)group

2.1.2實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果各組單個核細(xì)胞提取DNA與相應(yīng)引物進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，得出肝癌組與對照組的ND1和β-actin的擴(kuò)增曲線與溶解曲線，擴(kuò)增曲線呈明顯的S型曲線，表明所有樣品的目的產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增，即擴(kuò)增效率為100%，擴(kuò)增反應(yīng)良好；由溶解曲線可以看出PCR反應(yīng)引物具有較好的特異性，無引物二聚體、非特異性PCR產(chǎn)物和污染的存在(圖2)。

Fig. 2Amplification curves and dissociation curves of fluorescence quantitative PCR of ND1 and β-actin gene

A：Amplification curves of healthy control group； B：Dissociation curves of healthy control group； C：Amplification curves of hepatocellular carcinoma(HCC)group； D：Dissociation curves of HCC group; HCC: Hepatocellular carcinoma

分析30例健康人與25例肝癌患者外周血單個核細(xì)胞mtDNA ND1基因和內(nèi)參基因β-actin的熒光定量相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在健康對照組mtDNA ND1基因相對表達(dá)水平為1時，肝癌患者外周血單個核細(xì)胞的mtDNA ND1基因相對于健康對照組ND1基因的表達(dá)變化率為73%，提示肝癌患者外周血單個核細(xì)胞mtDNA ND1基因表達(dá)明顯降低(表2)。

Tab.

HCC: Hepatocellular carcinoma

2.2流式細(xì)胞儀測定單個核細(xì)胞活性氧含量

DCFH-DA負(fù)載后,Cell Quest軟件檢測分析得到的流式細(xì)胞術(shù)直方圖。由A陰性對照組“畫門”去除細(xì)胞本底熒光值，由B可以看出陽性藥物處理后熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，表明活性氧增多，證明探針可以與活性氧相互作用。圖C與圖D比較可以看出肝癌組平均熒光強(qiáng)度高于正常對照組，表明肝癌患者細(xì)胞活性氧含量增多(圖3)。平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)分析結(jié)果顯示：肝癌組細(xì)胞內(nèi)活性氧含量高于健康對照組(P<0.01，表3)。

Fig. 3Mean fluorescence intensity(MFI)of ROS in different groups

A：Negative control group； B：Positive control； C：Healthy control+probe； D：HCC+probe； ROS：Reactive oxygen species

2.3生化檢測法測定血漿總抗氧化能力

在波長520 nm，1 cm光徑，測定對照管與測定管吸光度值。正常人對照管吸光度值(A值)為(0.13±0.01)，測定管A值為(0.15±0.02)。肝癌組對照管A值為(0.10±0.03)，測定管A值為(0.09±0.03)。T-AOC肝癌組血漿總抗氧化能力明顯低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3，P<0.01)。

GroupnMFIofROST-AOC(Unit/mlplasma)Control30301.82±75.543.20±1.62HCC25417.82±110.62**1.30±0.85**

HCC: Hepatocellular carcinoma; T-AOC: Total antoxidant capability; PMBC: Peripheral blood mono-nuclear cell

**P<0.01vscontrol group

3　討論

原發(fā)性肝癌是目前世界上致死率最高的惡性腫瘤之一,在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。腫瘤的發(fā)生是一個多種信號網(wǎng)絡(luò)相互參與調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，隨著進(jìn)程的繼續(xù)，腫瘤細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出無限增殖、抵抗凋亡、逃避免疫監(jiān)督、侵襲與轉(zhuǎn)移以及出現(xiàn)異常的代謝途徑等標(biāo)志性特征。細(xì)胞免疫功能在肝癌患者抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，抽取肝癌患者外周血進(jìn)行檢測可以觀到CD4+和CD4+/CD8+比值較正常人群明顯下降，提示肝癌患者細(xì)胞免疫功能受抑制[10]。

線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的基地和供能的場所，供應(yīng)細(xì)胞生命活動95%的能量，線粒體受到損傷，細(xì)胞就會因缺乏能量而死亡，從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞喪失其免疫功能，有利于癌癥的發(fā)生和發(fā)展。已知mtDNA與細(xì)胞氧化磷酸化功能密切相關(guān),由于mtDNA缺少組蛋白保護(hù)所以易受內(nèi)源性損傷因子和外源性致癌物質(zhì)的攻擊而使mtDNA發(fā)生變化[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈氧化磷酸化不但與mtDNA的序列變化密切相關(guān),還與其拷貝數(shù)相關(guān)。線粒體DNA突變能引起線粒體呼吸酶復(fù)合體的缺陷，從而增加患癌的風(fēng)險。通過測序來自于不同部位的早期腫瘤的mtDNA基因序列發(fā)現(xiàn):64%的膀胱癌病人、46%的頭頸腫瘤病人及43%的肺癌病人的體液樣本存在著mtDNA的突變。這些突變最常見于NADH脫氫酶亞單位4(ND4)的基因和D-loop上。本實(shí)驗(yàn)通過對肝癌組和健康對照組的mtDNA拷貝數(shù)變化進(jìn)行檢測,結(jié)果表明肝癌組mtDNA拷貝數(shù)是健康對照組的0.73倍，表明肝癌患者mtDNA拷貝數(shù)下降。與文獻(xiàn)報道的胃癌mtDNA拷貝數(shù)下降的結(jié)論類似。

已有研究證實(shí)mtDNA的突變可引起電子轉(zhuǎn)運(yùn)元件的改變，從而影響正常的電子傳遞，導(dǎo)致氧化磷酸化系統(tǒng)功能障礙，生成大量的活性氧[12]。內(nèi)源性活性氧的升高可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂、蛋白和DNA等的氧化損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激，繼而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]。機(jī)體中存在多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，以阻止氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。一個體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶總的水平即該體系的總抗氧化能力。T-AOC是機(jī)體清除自由基的重要指標(biāo)，它的測量結(jié)果克服了單一的抗氧化指標(biāo)難以全面反映血漿抗氧化能力的不足。本實(shí)驗(yàn)通過檢測肝癌患者與健康對照組單個核細(xì)胞ROS含量與血漿總抗氧化能力發(fā)現(xiàn)肝癌患者細(xì)胞活性氧含量高于健康對照組，血漿總抗氧化能力低于健康對照組，證明肝癌患者體內(nèi)氧化抗氧化體系發(fā)生失衡。

因此,肝癌患者體內(nèi)存在外周血單個核細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)的下降與機(jī)體抗氧化體系的失衡，二者可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的生理和病理作用，但是具體的途徑和信號傳導(dǎo)過程還不清楚,有待進(jìn)一步研究。

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Changes of the mitochondrial DNA copy number and the antioxidant system in the PBMC of hepatocellular carcinoma

GAO Yuan1, NIE Hong-jing1, YANG Dong1, DING Cheng-shi1,2, JIN Min1, SHEN Zhi-qiang1,QIU Zhi-gang1, GUO Xuan1, CHEN Zhao-li1Δ, LI Jun-wen1Δ

(1. Institute of Health and Environmental Medicine， Academy of Military Medical Sciences， Tianjin 300050；2. Life Science College， Zaozhuang University， Zaozhuang 277160， China)

Objective: To investigate the relationship between the changes of the copy numbers of mtDNA in peripheral blood mono-nuclear cell(PBMC) and the disordered of antioxidant capacity of hepatocellular carcinoma(HCC) patients． Methods: The Ficoll Hypaque method was used to isolate the PBMC from blood specimens. The ND1 gene of the mitochondrial was amplified by real-time PCR；meantime β-actin was served as a quantitative standard marker; the difference of mtDNA copy number in PBMC was compared between HCC and healthy control group．The level of reactive oxygen species(ROS) in PBMC was determined by flow cytometry．The change of total antioxidant capacity (T-AOC) of plasma was detected by the biochemistry examination. Results: The copy numbers of ND1 gene in PBMC of HCC was 73% that of the healthy control group，which suggested a decrease of the copy numbers of mtDNA in HCC．The levels of ROS of PBMC in HCC was (417.82±110.62) and (301.82±75.54) in control group，which showed that the levels of ROS of PBMC in HCC were significant higher than that in control group(P<0.01)．Plasma T-AOC in HCC was (1.30±0.85)，and (3.20±1.62) in control．The T-AOC of plasma of HCC was significantly lower than in control group(P<0.01)． Conclusion: There was a certain relationship between the decrease of the copy numbers of mtDNA and the disordered antioxidant capacity in hepatocellular carcinoma, which may beassociated with the development of hepatocellular carcinoma．

hepatocellular carcinoma；mtDNA；ROS；T-AOC；PBMC

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471812)

2015-03-20

2015-06-26

△Tel：022-84655288, 022-84655345； E-mail：zhaolichen@126.com, junwen9999@hotmail.com

R735.7

A

1000-6834(2016)01-001-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.01.001