田新華，姜天瑞，翁海龍*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省科技成果轉(zhuǎn)化中心，哈爾濱150028)

?

興安落葉松的胚性愈傷組織誘導(dǎo)與體胚發(fā)生研究

田新華1，姜天瑞2，翁海龍1*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省科技成果轉(zhuǎn)化中心，哈爾濱150028)

對(duì)興安落葉松合子胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織及體細(xì)胞發(fā)生進(jìn)行研究，旨在解決落葉松無(wú)性系快速繁殖問(wèn)題，對(duì)于遺傳改良以及人工種子生產(chǎn)有重要意義。研究結(jié)果表明：1/4 LP(改良)培養(yǎng)基最適宜誘導(dǎo)胚性愈傷組織，同時(shí)添加激素6-BA 5×10-6M、NAA 5×10-8M的培養(yǎng)基中體胚誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)效果較好。

落葉松；離體培養(yǎng)；體胚發(fā)生

落葉松(Larixgemelinii)原產(chǎn)于北半球的北溫帶地區(qū)和喜瑪拉雅山脈，該屬約有18個(gè)種，分布范圍較廣，東北地區(qū)最多[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，落葉松林木的蓄積量在東北地區(qū)占針葉林總蓄積量的39.4%；占黑龍江省用材林蓄積量的23.6%，其中大興安嶺林區(qū)占用材林總蓄積量的67%[2]，是我國(guó)東北地區(qū)的主要造林樹(shù)種。落葉松比松樹(shù)和云杉生長(zhǎng)快，以早期速生、抗逆性強(qiáng)著稱(chēng)，且落葉松木材重而堅(jiān)實(shí)，抗壓及抗彎曲的強(qiáng)度大，而且耐腐朽，木材工藝價(jià)值較高。落葉松木纖維長(zhǎng)，纖維的長(zhǎng)寬比大，管胞壁厚，生產(chǎn)的紙張具有較高的強(qiáng)度、拉力，耐破指數(shù)高。所以大量用于建筑業(yè)、裝演業(yè)、造紙業(yè)[3-5]。但是落葉松生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，有性繁殖后代變異較大；落葉松扦插繁殖生根率很低[6]；在高寒地區(qū)的限制因素很多，所以對(duì)一些優(yōu)良性狀難以維持，大規(guī)模繁殖利用難度較大。嚴(yán)重地影響了落葉松遺傳改良的進(jìn)程，限制了落葉松良種使用比率和發(fā)展速度。本研究旨在利用組織培養(yǎng)的方法更快更好地誘導(dǎo)出興安落葉松的胚性愈傷組織或體胚，在短期內(nèi)可以獲得大量遺傳上和形態(tài)上均一的苗木[6]，為遺傳改良以及人工種子生產(chǎn)等方面奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)供試材料來(lái)源于林口青山落葉松國(guó)家良種基地興安落葉松的成熟種子，分別于6月、9月、12月不同時(shí)間進(jìn)行分批試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子的清洗與消毒。將種子用蒸餾水浸洗20min，分別采用70%酒精和0.1%HgCl2與70%酒精和3%NaClO進(jìn)行滅菌處理，然后在超凈工作臺(tái)下用無(wú)菌水反復(fù)漂洗6次，每次漂洗2 min，取出種子用濾紙吸干多余水分，備用。

1.2.2基本培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)。采用眼科剪子與解剖刀剝?nèi)〕墒旆N子的合子胚為外植體，分別接種于MSG、DCR、1/4LP(改良)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。每皿培養(yǎng)2個(gè)外植體，每個(gè)處理5皿，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3外植體的誘導(dǎo)與分化培養(yǎng)

誘導(dǎo)培養(yǎng)：將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗無(wú)光條件進(jìn)行暗培養(yǎng)，溫度控制在23±2℃。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。

分化培養(yǎng)：將胚性愈傷組織、早期體胚接種于分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在23±2℃。培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8。

將外植體放于直徑為5cm的塑料皿內(nèi)，皿中含有培養(yǎng)基5mL。用封口膜封口，再用鋁箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒溫培養(yǎng)，30d繼代1次。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)愈傷組織、體細(xì)胞胚的出現(xiàn)數(shù)，分別計(jì)算出愈傷組織、體細(xì)胞胚產(chǎn)生的百分?jǐn)?shù)。

體胚發(fā)生率=產(chǎn)生體胚的幼胚的數(shù)量/接種培養(yǎng)的所有胚的數(shù)量×100%。

胚性愈傷誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷的幼胚的數(shù)量/接種培養(yǎng)的所有胚的數(shù)量×100%。

試驗(yàn)獲得的愈傷組織用解剖鏡記錄、拍照。培養(yǎng)30d統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，采用Excel 2003和dps7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和多重比較[7]。

2　結(jié)果與分析

2.1不同滅菌方法對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體的消毒處理是植物組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)，具體的消毒方案因植物材料和取材時(shí)期而異。對(duì)興安落葉松種子進(jìn)行消毒處理，培養(yǎng)10d統(tǒng)計(jì)外植體的污染率，結(jié)果如表1所示，不同處理對(duì)外植體污染率和啟動(dòng)率的影響不同。HgCl2的消毒處理導(dǎo)致的污染率最高，為70.0%，比NaClO消毒處理12min的污染率高2倍多；而NaClO消毒時(shí)間長(zhǎng)短的差別不是很明顯，以消毒處理12min表現(xiàn)最好，為26.7%，因此以NaClO 消毒處理12min為興安落葉松種子表面滅菌的最佳方法。

表1　不同處理方法對(duì)興安落葉松種子滅菌效果的影響

2.2基本培養(yǎng)基對(duì)興安落葉松體胚發(fā)生啟動(dòng)的影響

對(duì)6月份處理的種子進(jìn)行消毒處理接種于不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)30d培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)(如表2所示)，合子胚在本試驗(yàn)所采用不同基本培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生愈傷組織，但是愈傷組織的誘導(dǎo)率差異顯著。這說(shuō)明，基本培養(yǎng)基的種類(lèi)對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率影響較大，其中培養(yǎng)基MSG和DCR對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較低且差異不顯著，而與1/4LP(改良)培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率相比差異顯著(P<0.05)。興安落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率以1/4LP(改良)培養(yǎng)基最高，并且培養(yǎng)基中的外植體產(chǎn)生白色、透明絲狀胚性愈傷組織。

表2　不同培養(yǎng)基上的興安落葉松

注：不相同字母表示有顯著差異(P<0.05)，下同。

2.3激素組合對(duì)興安落葉松體胚發(fā)生啟動(dòng)的影響

表3　不同激素組合對(duì)興安落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

我們將不同時(shí)期所取的外植體按照下列組合進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的濃度配比對(duì)外植體脫分化形成愈傷組織起著關(guān)鍵的控制作用。如表3所示，隨著激素2,4-D濃度的提高，愈傷組織誘導(dǎo)率也隨之提高，形成有粘性且松散的愈傷組織，這說(shuō)明適當(dāng)?shù)奶岣?,4-D的濃度有必要的。6-BA、KT濃度增加時(shí)，也可促進(jìn)愈傷組織增長(zhǎng)，但是繼代之后發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織的胚性開(kāi)始喪失，這說(shuō)明繼代適當(dāng)?shù)馗鼡Q培養(yǎng)基來(lái)保證胚性愈傷組織的保持與增殖是有必要的。

2.4興安落葉松胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)及體胚發(fā)生的影響因素

選用1/4 LP(改良)培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別附加不同濃度6-BA 、NAA進(jìn)行胚性愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

將離體胚平放于直徑為5cm的塑料皿內(nèi)，皿中含有培養(yǎng)基5mL。用封口膜封口，再用鋁箔把皿包裹，放于20℃暗培室中恒溫培養(yǎng)，30d繼代1次。

繼代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有部分白色或淺黃色愈傷組織逐漸褐化，松散狀也轉(zhuǎn)換成致密不透明，失去分化能力。隨著激素濃度的調(diào)整有部分未褐化的胚性愈傷組織逐漸誘導(dǎo)體胚發(fā)生，其中以濃度為6-BA 5×10-6M和NAA 5×10-8M誘導(dǎo)效果最好，即1/4 LP(改良)+6-BA5×10-6M+NAA 5×10-8M培養(yǎng)基中體胚誘導(dǎo)率較高，誘導(dǎo)效果較好。

3　小結(jié)

3.1在落葉松體胚發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配比對(duì)外植體脫分化形成胚性愈傷組織起著重要的調(diào)控作用。因此必須通過(guò)調(diào)整各激素濃度之間配比才更有利于體胚發(fā)生。

3.2本試驗(yàn)以成熟合子胚的外植體誘導(dǎo)胚發(fā)生，盡管在繼代過(guò)程中褐化、死亡，但以成熟合子胚的外植體誘導(dǎo)落葉松體胚的發(fā)生還是可行的，今后還要繼續(xù)探索各激素的合理配比進(jìn)一步提高體胚發(fā)生的誘導(dǎo)率。

附圖　球形胚

[1]王企明.松樹(shù)[M].南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[2]賈治邦.中國(guó)森林資源報(bào)告：第七次全是森林資源清查[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2009.

[3]周崟.中國(guó)落葉松屬木材[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2001:171-179.

[4]李堅(jiān).木材科學(xué)[M]. 北京：高等教育出版社,2003:257-259.

[5]李堅(jiān).中國(guó)主要樹(shù)種木材物理力學(xué)性質(zhì)[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2006:147-154.

[6]王彥清，吳克賢，張泉.胡桃揪體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究[J].林業(yè)科技，2000,25(2):8-9.

[7]唐啟義,馮明光.實(shí)用統(tǒng)計(jì)分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[M].北京:科學(xué)出版社,2002.

Induction of Embryogenic Callus and Somatic Embryogenesis in Larix gemelinii

Tian Xinhua1，Jiang Tianrui2，Weng Hailong1*

(1.Heilongjiang Institute of Forestry Sciences,Harbin,Heilongjiang 150081;2. The center of Scientific and Technological Achievements of Heilongjiang Province,Harbin,150028)

this study zygote embryo ofLarixgemeliniiinduction of embryonic callus and somatic cells, aims to solve the problem of larch clones reproduce rapidly, has important significance for genetic improvement and artificial seed production. The results showed that the 1/4 LP (improved) medium for embryonic callus induction was suitabled, while adding hormone 6-BA 5 × 10-6m, NAA, 5 × 10-8m medium term embryo rate was higher, the induced effect was better.

Larixgemelinii；In vitro culture；Somatic embryogenesis

2016-02-18

黑龍江省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)“落葉松無(wú)性系扦插育苗配套技術(shù)研究”資助

田新華，女，碩士，副研究員，主要從事森林培育方面研究，E-mail:tianjie1976@sina.com；*通訊作者：翁海龍，碩士，副研究員，主要從事林木育種方面研究，E-mail:dl5529@gmail.com。

S436.611

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2016.04.005