何　濤　胡　佳　張　韜　于世海

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壯陽(yáng)作用藥酒中枸櫞酸西地那非非標(biāo)研究

何濤1胡佳1張韜1于世海2

目的研究并建立高效液相色譜法及薄層色譜法測(cè)定壯陽(yáng)作用藥酒中枸櫞酸西地那非非法添加方法。方法高效液相色譜法及薄層色譜法。結(jié)果薄層色譜法：GF254薄層板，以正己烷-乙醇-氨水(30∶70∶1)為展開(kāi)劑，在碘蒸汽中熏5分鐘后，置254nm紫外燈下檢視。高效液相色譜法：C18柱，流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸三乙胺(取7ml三乙胺用水稀釋至1000ml,用磷酸調(diào)至3.0)-甲醇-乙腈(58∶25∶17)，檢測(cè)波長(zhǎng)290nm。結(jié)論此高效液相色譜法及薄層色譜法測(cè)定壯陽(yáng)作用藥酒中枸櫞酸西地那非可靠有效。

枸櫞酸西地那非; 非法添加; 高效液相色譜法; 薄層色譜法

有壯陽(yáng)作用藥酒，宣稱純中藥制成，無(wú)西藥添加，用過(guò)的人幾小時(shí)之內(nèi)起效居多，懷疑有西藥添加，所以首先選擇枸櫞酸西地那非進(jìn)行排查。枸櫞酸西地那非也叫萬(wàn)艾可，中文簡(jiǎn)稱“偉哥”，它是西地那非的枸櫞酸鹽，一種對(duì)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)特異的5型磷酸二酯酶(PDE5)選擇性抑制劑[1]。 作用機(jī)制：陰莖勃起的生理機(jī)制涉及性刺激過(guò)程中陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮(NO)的釋放。NO激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶導(dǎo)致環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)水平增高，使海綿體內(nèi)平滑肌松弛，血液充盈。西地那非(Sildenafil，Viagra,萬(wàn)艾可) 是高度選擇性磷酸二酯酶5(PDE5)抑制劑，PDE5在陰莖海綿體中高度表達(dá)，而在其它組織中(包括血小板、血管和內(nèi)臟平滑肌、骨骼肌)表達(dá)低下。西地那非通過(guò)選擇性抑制PDE5，增強(qiáng)一氧化氮(NO)-cGMP途徑，升高cGMP水平而導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌松弛，使勃起功能障礙患者對(duì)性刺激產(chǎn)生自然的勃起反應(yīng)。勃起反應(yīng)一般隨西地那非劑量和血漿濃度的增加而增強(qiáng)[2]。實(shí)驗(yàn)顯示，藥效可持續(xù)至4小時(shí)，但反應(yīng)較2小時(shí)時(shí)弱[3]。本文通過(guò)高效液相色譜法及薄層色譜法鑒別及測(cè)定壯陽(yáng)作用藥酒中枸櫞酸西地那非含量，證明此壯陽(yáng)作用藥酒中有枸櫞酸西地那非非法添加。

1　儀器與試藥

CPA-225D型電子天平，LC-2010CHT型高效液相色譜，有壯陽(yáng)作用藥酒，三乙胺(分析純)，磷酸(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，甲酸(分析純),過(guò)氧化氫(分析純),氨水(分析純)，正己烷(分析純)，乙醇(分析純)，枸櫞酸西地那非對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)101400-201301)，水為純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜

2.1.1供試品溶液制備取本品，以每分鐘3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取10ml上清液，以混合制劑[甲醇-水-氨水(75∶25∶1)]稀釋至100ml搖勻，作為供試品溶液。

2.1.2對(duì)照品溶液制備另取枸櫞酸西地那非對(duì)照品約10mg,置20ml量瓶中，加上述混合制劑溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，照薄層色譜試驗(yàn)，取上述兩種溶液各5μl,分別點(diǎn)于同一GF254薄層板上，以正己烷-乙醇-氨水(30∶70∶1)為展開(kāi)劑，層析缸預(yù)先以展開(kāi)劑飽和20分鐘。展開(kāi)后晾干，在碘蒸汽中熏5分鐘后，置254nm紫外燈下檢視[4]。

2.1.3結(jié)果供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。(見(jiàn)圖1)

1.對(duì)照品　2.供試品圖1　薄層色譜圖

2.2高效液相色譜法

2.2.1色譜條件色譜柱為Symmetry C18柱(150mm ×4.6mm，54um)；流動(dòng)相為0.05mol/L磷酸三乙胺(取7ml三乙胺用水稀釋至1000ml,用磷酸調(diào)至3.0)-甲醇-乙腈(58∶25∶17)；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：25℃。

2.2.2供試品溶液制備[5]取本品，以每分鐘6000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取上清液10ml，置于20ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.3對(duì)照品溶液制備精密稱取枸櫞酸西地那非對(duì)照品約10mg,置100ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，取2ml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，即得。

2.2.4方法學(xué)考察

2.2.4.1專屬性試驗(yàn)取2.2.2項(xiàng)下的供試品溶液和2.2.3項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，按擬定色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖2、圖3。結(jié)果表明，藥酒中其他成分及輔料對(duì)枸櫞酸西地那非的測(cè)定無(wú)干擾，方法專屬性好，枸櫞酸西地那非的保留時(shí)間約為8.8分鐘，分離度為2.56，理論板數(shù)為5625。

圖2　對(duì)照品溶液色譜圖

圖3　供試品溶液色譜圖

2.2.4.2精密度考察取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μl，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD為0.5%。

2.2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液，在0、2、4、6、8小時(shí)進(jìn)樣，共五次，每次20μl，測(cè)定峰面積積分值，結(jié)果RSD為0.7%，表明枸櫞酸西地那非在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)取樣品，按供試品溶液制備方法制備6個(gè)，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)(n=6)，按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果RSD為1.0%。

2.2.4.5回收率試驗(yàn)取已測(cè)含量樣品，平行6份，分別精密加入枸櫞酸西地那非對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備和測(cè)定，計(jì)算6次的回收率，分別為99.5%，99.4%，99.6%，99.4%，99.5%,99.5%，平均回收率為99.5%，RSD為0.1%。

2.2.5樣品含量測(cè)定按上述供試品之輩方法處理，進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中枸櫞酸西地那非的含量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　枸櫞酸西地那非含量

3　討論

通過(guò)薄層色譜法及高效液相色譜法，鑒別及測(cè)定壯陽(yáng)作用藥酒中枸櫞酸西地那非含量，方法安全可靠。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2011.

[2]黃力,楊寧,劉海英,等.壯陽(yáng)類中藥中枸櫞酸西地那非的檢出[J].中國(guó)中醫(yī)藥資訊,2010，2(2)：42.

[3]戚亮，崔琳.HPLC法測(cè)定枸櫞酸西地那非的含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2013, 26(5)：755-757.

[4]魏尊喜.HPLC與TLC測(cè)定保健品中枸櫞酸西地那非含量[J].安徽醫(yī)藥, 2007，11(12):1097-1098.

[5]楊德忠，黃惠宏.HPLC法測(cè)定枸櫞酸西地那非片的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2002，18(4):235-236.

1.遼寧省錦州市食品藥品檢驗(yàn)所(錦州 121000); 2.遼寧康辰藥業(yè)有限公司(丹東 118301)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.14.022

1003-8914(2016)-14-2039-02

(本文校對(duì)：李盈2015-12-03)