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【實驗研究】

御寒暖胃膏對慢性萎縮性胃炎修復機制的影響*

謝宇鋒1陳赟1馮軍1△楊宗保2吳云天1王曙輝1

目的研究御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜TNF-α、PCNA表達的影響，探討御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠胃黏膜損傷修復的作用機制。方法大鼠隨機分為正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組、藥物對照組，采用綜合干預方法復制慢性萎縮性胃炎癌前病變大鼠模型，光鏡下觀察胃黏膜組織的病理變化，采用酶聯(lián)免疫分析法測定胃黏膜細胞中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、增殖細胞核抗原( PCNA) 的表達水平。結果與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜組織病理學檢查提示存在腺體萎縮和一定程度的細胞異型增生，大鼠胃黏膜細胞中TNF-α、PCNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組和藥物對照組大鼠胃黏膜組織的病理損傷得到明顯修復，大鼠胃黏膜細胞中TNF-α、PCNA的表達水平明顯降低(P<0.05)。結論御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴可以促進CAG大鼠胃黏膜損傷的修復，該作用可能是通過調(diào)節(jié)胃黏膜細胞TNF-α、PCNA的表達水平來實現(xiàn)的。

御寒暖胃膏；穴位貼敷；慢性萎縮性胃炎；腫瘤壞死因子α；增殖細胞核抗原

慢性萎縮性喟炎(Chronic Atrophic Gastritis，CAG)作為胃癌的癌前病變，是慢性胃炎向胃癌發(fā)展的必經(jīng)階段，也是防治胃癌的關鍵節(jié)點。本課題組運用中醫(yī)外治法經(jīng)典著作《理瀹駢文》所記載的“御寒暖胃膏”貼敷胃經(jīng)穴足三里、梁門干預慢性萎縮性胃炎患者，較好地改善了患者的臨床癥狀，并在一定程度上促進慢性萎縮性胃炎胃黏膜腺體萎縮、細胞異型增生的逆轉。為進一步明確御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴對慢性萎縮性胃炎的作用，并闡述其可能的作用機制，為臨床開展御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴治療慢性萎縮性胃炎提供科學的實驗依據(jù)，本課題組開展了以下實驗，具體介紹如下。

1　材料

1.1實驗動物合格SD(Sprague-Dawley Rat)大鼠28只，雄性，清潔級，8周齡，體質量200～250 g，購于江西中醫(yī)藥大學實驗動物中心(JZDWNO：2013-1056)。大鼠飼養(yǎng)于墊鋸木屑的飼料籠中，每籠10只，控制室溫22℃，相對濕度50%，采用自然光暗周期，自由飲水，檢疫3周后分組實驗。

1.2試劑與藥品御寒暖胃膏組成為：生姜160 g，凡士林48 g，乳香3 g，沒藥3 g，川椒6 g，所有中藥均購自深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥房，并且于深圳市福田區(qū)中醫(yī)院中藥煎藥房制成膏藥；維酶素片(河北環(huán)海藥業(yè)有限公司，批號：20120214)；N-甲基-N`-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)(日本東京化成株式會社)。

2　方法

2.1實驗分組將28只大鼠按體質量排序，然后按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，每組7只，分別為：正常組、模型組、御寒暖胃膏貼敷胃經(jīng)穴組(下稱：穴位貼敷組)、藥物對照組。

2.2藥品制備

2.2.1御寒暖胃膏的制備(1)膏藥的組成：生姜800 g，凡士林240 g，乳香15 g，沒藥15 g，川椒30 g。(2)膏藥的制備方法：①研磨藥粉：將乳香、沒藥、川椒分別研碎成粉末(100目篩)，按份量稱好以備用。②制備姜汁：將生姜榨成汁，倒入燒杯中，用酒精燈加熱至沸騰。③溶化藥物：首先加熱融化凡士林，然后加入乳香、沒藥，并不斷用玻璃棒攪拌至乳香、沒藥融化為止，然后與煮沸后的姜汁混勻，再加熱至滴水不化。④冷卻撒藥：熄火待膏藥溫度降至60攝氏度時，將備好的藥粉往膏中撒布并繼續(xù)攪拌，冷卻備用。

2.2.2維酶素灌胃液的制備將維酶素藥片整片放入玻璃研磨皿中研磨成粉，按比例加入純凈水，將藥物配成21.6mg/ml的溶液(人的維酶素給藥劑量是2.4 g/d，人與大鼠的換算系數(shù)0.018，則大鼠的劑量為216mg/kg，根據(jù)大鼠體質量換算灌胃量)，然后按照大鼠的體質量，按1ml/ 100 g的用量予以灌胃，1次/日。

2.2.3MNNG溶液的制備MNNG溶液每周先用純凈水配成1 g/L濃度的儲存液，避光4℃保存，用時將其配成150μg/ml的飲用液，并置于光屏蔽瓶中讓大鼠自由飲用。

2.2.42%的水楊酸鈉溶液的制備使用天秤稱取水楊酸鈉和純凈水，按1∶48的比例配成2%的水楊酸鈉溶液，以備造模使用。

2.2.530%的乙醇溶液的制備使用天秤稱取無水乙醇和純凈水，按3∶7的比例配成30%的乙醇溶液，以備造模使用。

2.3模型復制方法按照嚴茂祥[1]報道的綜合造模方法，將SD大鼠分組后，除正常對照組外，其余3組大鼠采取嚴茂祥的綜合方法復制CAG癌前病變動物模型，為期20周。①在飲水中加入MNNG溶液進行造模，讓大鼠自由飲用，正常組自由飲用自來水。②2%水楊酸鈉溶液灌胃：單日一次，按10ml/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1小時。③30%酒精溶液灌胃，雙日一次，按10ml/kg的劑量給大鼠灌胃，灌胃前后禁食禁水1小時。④對造模動物每日均用專用夾子夾尾一次，使其保持激怒、爭斗狀態(tài)，持續(xù)1小時。⑤饑飽失常法：2天足量喂食，1天停食，循環(huán)實施。

2.4干預方法

2.4.1正常組喂飼標準飼料，不予任何處理。

2.4.2模型組第21周開始，每天捆綁1小時，并予膠布貼敷肚子及雙下肢，每只每天按1ml/100 g的用量經(jīng)口灌服純凈水。

2.4.3穴位貼敷組①選穴與取穴：胃經(jīng)穴分別選取足三里與梁門。②貼敷方法：第21周開始，每天將各組大鼠捆縛于鼠板,將膏藥涂于所選部位上，直徑為0.3cm，厚度為0.2cm，外用醫(yī)用膠布固定，每日1小時。③每只每天按1ml/100 g的用量經(jīng)口灌服純凈水。

2.4.4藥物對照組維酶素溶液，按21.6mg/kg的藥量給藥，1次/日，每天捆綁1小時，并予膠布貼敷肚皮及雙下肢。

2.4.5從第21周開始，各組按照上述方案共干預8周。

2.5動物處理及標本采集

2.5.1動物處理經(jīng)過8周干預結束后，大鼠處理前24h禁食不禁水，稱量體質量后，在超凈工作臺下，按照0.3ml/100 g的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后腹部朝上置于鼠板上，用手術刀迅速打開大鼠腹腔，取出胃部。用眼科剪刀沿胃大彎剪開胃并翻轉。用冰1%DEPC0.9%氯化鈉溶液漂洗胃內(nèi)容物，采用吸水紙將組織的水分吸干，取全小彎側上至食管下至十二指腸的胃組織以備病理切片用；鈍性分離胃竇黏膜，裝在凍存管中，并用液氮冷凍，后儲存于-80℃冰箱內(nèi)以備用。

2.5.2病理切片標本采集從上述備用組織中取1cm×0.5cm 大小的組織塊,0.9%的氯化鈉溶液沖洗干凈，然后將所取標本放入10%的甲醛溶液內(nèi)固定24～48h, 常規(guī)進行石蠟包埋,不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，切片厚4μm。

2.5.3ELISA標本采集從上述備用組織中剪取胃腺部1cm×1cm大小的組織塊，稱重。用眼科剪將所取的組織塊盡量剪碎，用移液管加入0.1M冰PBS緩沖液(按：組織塊重量∶緩沖液體積=1∶9)。將所獲得的組織混懸液使用勻漿機在冰上以10000r/min研磨成10%的組織勻漿(勻漿時間10s/次，間隔30s，反復3～5次)。將所獲得的勻漿液移入干凈的離心管中，并使用冷凍離心機，以4℃、3000rpm離心15min。然后將離心管內(nèi)的上清液轉移至新的潔凈EP管中，放入-80℃冰箱備用。

2.6觀測指標與方法

2.6.1胃黏膜的病理形態(tài)學將4組動物的胃體部切取5mm×7mm 大小的胃組織, 用10% 福爾馬林固定液固定1周后, 常規(guī)石蠟包埋切片, HE染色, 光鏡下觀察。

2.6.2按照大鼠胃黏膜細胞TNF-α、PCNA的ELISA試劑盒使用說明書中的操作步驟進行操作。

2.7統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，組間比較若滿足正態(tài)分布且方差齊時采用單因素方差分析，組間不全相同時采用LSD進行兩兩比較，方差不齊選擇Tamhane T2法進行方差檢驗和兩兩比較，若不滿足正態(tài)性時采用秩和檢驗，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。

3　結果

3.1各組胃黏膜組織病理學的變化情況圖1-8光鏡顯示：正常組大鼠各層胃組織結構完整，上皮細胞、腺體大小形態(tài)均勻、排列有序，腺上皮與腺管分界清楚，固有腺及黏膜無擴張淤血，黏膜肌層無增生，未見病理性核分裂象(圖1-2)。模型組大鼠黏膜層腺管形態(tài)及大小不規(guī)側，存在囊狀擴張的腺管，腺管結構紊亂，細胞核大小不等，在高倍鏡下細胞核比例增大、濃染，細胞核呈桿狀或類圓形，排列參差不齊，可見核分裂象(圖3-4)。穴位貼敷組、藥物對照組大鼠胃黏膜生長較模型組有所好轉，其黏膜厚度與皺壁有所恢復，黏膜未見明顯水腫、萎縮、炎癥，腺體排列較整齊，腺體囊狀擴張較少，未見明顯萎縮，高倍鏡下細胞核大小較均勻，排列整齊，未見病理性核分裂象(圖5-8)。

圖1　正常組(×100)

圖2　正常組(×400)

圖4　模型組(×400)

圖5　穴位貼敷組(×100)

圖6　穴位貼敷組(×400)

圖7　藥物對照組(×100)

圖8　藥物對照組(×400)

3.2各組大鼠胃黏膜TNF-α水平的比較與正常組相比，模型組的大鼠胃黏膜TNF-α明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，穴位貼敷組、藥物對照組的大鼠胃黏膜TNF-α明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠胃黏膜TNF-α的比較(單位：ng/L)　

注：各組經(jīng)方差分析示，F(xiàn)=53.66，P=0.000<0.05；與正常組比較，1)P=0.000<0.05；與模型組比較，2)P=0.000<0.05

3.3各組大鼠胃黏膜PCNA水平的比較與正常組相比，模型組的大鼠胃黏膜PCNA水平明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，穴位貼敷組、藥物對照組的大鼠胃黏膜PCNA水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2各組大鼠胃黏膜PCNA水平的比較(單位：ng/ml)

組別樣本數(shù)PCNA正常組72.88±0.38模型組74.55±0.281)穴位貼敷組組73.33±0.462)藥物對照組73.81±0.372)

注：各組經(jīng)方差分析示，F(xiàn)=22.27，P=0.000<0.05；與正常組比較，1)P=0.000<0.05；與模型組比較，2)P=0.000<0.05

4　討論

御寒暖胃膏來源于清代中草藥外治專家吳師機所著的《理瀹駢文》一書，該書大力推崇和發(fā)展膏藥穴位貼敷這一外治法，記載“御寒暖胃膏，主治：胃傷，不思飲食，胸腹脹痛，嘔噦惡心，噫氣吞酸，怠惰嗜臥，并治腰背冷痛。用法：糝花椒貼中脘處，藥物：生姜汁熬牛膠化開，以乳香、沒藥、黃丹收?！苯Y合本方的配伍，不難看出本方具有溫中和胃、活血祛瘀之效，且其所描述的癥狀與CAG的臨床表現(xiàn)極為相似，雖然在中醫(yī)學中并無CAG癌前病變這一病名，但早在《靈樞·經(jīng)脈》就有記載：“足陽明之脈，是動則病，食則嘔，胃脘痛”。本病病因主要與飲食不節(jié)、情志失司、素體虛弱、用藥不當?shù)纫蛩赜嘘P。其病機為本虛標實、虛實夾雜，本虛為脾胃虛弱，邪實重在氣滯血瘀，病位在胃，涉及脾、腎、肝，血瘀是本病發(fā)生的重要致病因素。因此，本病的中醫(yī)治療應在溫中健脾、益氣和胃的基礎上，佐以活血化瘀。正與本方的攻效甚為相符。因此，本研究團隊進行了大膽嘗試，取得了較為理想的效果，并開展了相關的機制研究，以探索其作用途徑。

慢性萎縮性胃炎其病理表現(xiàn)主要是以胃黏膜上皮和腺體萎縮、黏膜變薄或伴有腸腺化生、不典型增生為特征。CAG作為胃癌的癌前病變，其發(fā)生與胃癌的發(fā)生一樣是受多基因調(diào)節(jié)、多步驟漸進的過程。在致病因素的持續(xù)作用下導致原癌基因、抑癌基因、DNA修復基因、細胞黏附分子、端粒、端粒酶、細胞周期調(diào)節(jié)因子和生長因子、受體系統(tǒng)等多個基因的結構和表達異常，這些改變的積累最終導致正常胃黏膜的細胞增殖和凋亡失去平衡，從而導致由正常上皮細胞轉變成癌前病變甚至胃癌細胞。TNF之所以獲得這樣的命名，是因在最初發(fā)現(xiàn)時其是一種可致腫瘤快速出血壞死的物質，但后續(xù)的研究也提示其有促腫瘤作用。相關的研究認為TNF-α促腫瘤作用的機制是多途徑的，可能與其過度表達并與受體結合，通過多條信號通路抑制細胞凋亡及促進細胞增殖有關，其中以NF-κB途徑的研究較為深入，如：TNF-α可以調(diào)節(jié)端粒酶活性，通過NF-κB中的 p65導致人類端粒酶催化亞基 (hTERT)從胞質易位到核，最終推動細胞無限增殖[2]；通過 NF-κB途徑誘導激活的胞苷脫氨酶大量產(chǎn)生，引起腫瘤相關基因如 p53和 c-myc基因突變[3]。TNF-α在腫瘤微環(huán)境中還可以導致 DNA損傷，增加致瘤性[4]。PCNA又稱周期素，在啟動細胞增殖中起著重要作用，參與細胞周期調(diào)控、復制、修復和凋亡等細胞分化的全過程[5]；此外，PCNA還是對DNA復制起重要調(diào)節(jié)作用的DNA聚合酶δ的輔助蛋白之一，其表達的異常，可以直接導致DNA的復制發(fā)生異常，使致畸率大大提高[6]。PCNA 表達主要見于細胞增殖周期中的S 期和G2 早期，過度陽性表達表明細胞處于活躍的增殖狀態(tài)[7]。由此可見，TNF-α、PCNA作為調(diào)節(jié)細胞增殖與凋亡的重要活性因子，在腫瘤及癌前病變的發(fā)展過程中起著重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)：在CAG大鼠的胃黏膜組織病理學檢查提示存在細胞異型增生，大鼠胃黏膜TNF-α水平明顯升高，PCNA呈現(xiàn)高表達。由此可見，CAG大鼠胃黏膜細胞的異常增生，可能與致病因素導致胃黏膜損傷，激發(fā)TNF-α等炎性因子的釋放，并啟動胃黏膜損傷修復有關。但長時間、多因素的作用下導致其過度表達，抑制細胞凋亡、促進細胞增殖，從而導致胃黏膜細胞處于活躍的增殖狀態(tài)，表現(xiàn)為PCNA高表達，最終導致胃黏膜細胞異型增生。而穴位貼敷組和口服維酶素片可以在一定程度上逆轉胃黏膜細胞的異常增生，且可以下調(diào)TNF-α、PCNA水平。國內(nèi)外學者的研究顯示，足陽明經(jīng)穴對與胃相關的中樞及外周神經(jīng)電生理、胃運動、胃分泌等均有明顯調(diào)整作用[8，9]，以穴位為基礎的干預方法，可以實現(xiàn)對胃腸道活性因子的調(diào)節(jié)，并實現(xiàn)胃黏膜的損傷修復[10～12]。在本課題組的早期研究也證實，與非經(jīng)非穴點相比，御寒暖胃膏貼敷于胃經(jīng)之足三里穴和梁門穴對CAG大鼠胃黏膜損傷的修復作用、血流量等的影響均有明顯的差異[13]。所以可見穴位貼敷組可能是御寒暖胃膏作用于胃經(jīng)穴，并激發(fā)經(jīng)氣并調(diào)節(jié)胃腑黏膜運動、分泌等功能，如本研究發(fā)現(xiàn)的下調(diào)TNF-α、PCNA表達，從而實現(xiàn)對CAG大鼠胃黏膜的修復，減輕胃黏膜的慢性炎癥，最終達到抑制細胞過度增殖的作用。

綜上所述，穴位貼敷組對慢性萎縮性胃炎癌前病變的干預作用機制明確，該方法值得臨床推廣應用。

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The Effect of Yuhan Nuanwei Paste on Repair Mechanisms of Chronic Atrophic Gastritis

XIE Yufeng1CHEN Yun1FENG Jun1△YANG Zongbao2WANG Shuhui1,WU Yuntian1

(1.Department of Acupuncture and Massage, Shenzhen Futian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangdong,Shenzhen 518000, China；2.Medical College of Xiamen University, Fujian, Xiamen 361005, China)

ObjectiveTo study the effect of Yuhan Nuanwei paste on TNF-α and PCNA in gastric mucosa of chronic atrophic gastritis (CAG) rat, and to explore the repair mechanisms of Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian on chronic atrophic gastritis and precancerous lesions of CAG rat gastric mucosal injury. MethodsThe rats were randomly divided into normal group, model group, Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian group and drug control group. By using the comprehensive intervention method to copy precancerous lesions of chronic atrophic gastritis rats' model, the index of the gastric mucosa injury in rats was observed under the naked eye. Then we observed the pathological changes of gastric mucosa tissue using enzyme-linked immunoassay determination of the expression of levels of tumor necrosis factor alpha in gastric mucosa cells (TNF-α), proliferating cell nucleus antigen (PCNA). ResultsComparing with the normal group, the model group's rat's gastric mucosa histopathological examination suggested the existence of gland atrophy and a certain degree of cell hyperplasia. The TNF-α and PCNA of rat gastric mucosa cells increased significantly (P<0.05). Comparing with the model group, the pathological damage obviously repaired of the Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian group and the drug control group. The TNF-α and PCNA of rat gastric mucosa cells significantly decreased (P<0.05). ConclusionThe Yuhan Nuanwei paste on the stomach meridian can promote the CAG rats' gastric mucosa damage repair, and the effect may be through adjusting the TNF-α and PCNA by gastric mucosa cells to come true.

Yuhan Nuanwei paste; Acupoint sticking; Chronic atrophic gastritis; Tumor necrosis factor alpha; Proliferating cell nuclear antigen

深圳市科技研發(fā)資金項目(No.JCYJ20130401105615482)

1.廣東省深圳福田區(qū)中醫(yī)院針灸推拿科(深圳 518000)；2.廈門大學醫(yī)學院(廈門 361005)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.14.021

1003-8914(2016)-14-2034-05

(本文校對：楊麗霞2015-12-14)