張慶　劉彥斌　曹平虎　曾鑫　劉杰

血漿microRNAs：HCV陽性肝硬化新的生物標(biāo)記物

張慶劉彥斌曹平虎曾鑫劉杰

目的 探討血清microRNA（miRNA）在丙型肝炎病毒陽性的肝硬化中的表達(dá)情況。方法 采用實(shí)時定量PCR（Real-time PCR）的方法檢測miR-30c-5p和miR-302c-3p在丙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒陽性的肝硬化患者血清中的表達(dá)。結(jié)果 miR-30c-5p和miR-302c-3p在丙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒陽性的肝硬化患者中表達(dá)均增高。結(jié)論 丙型肝炎病毒陽性的肝硬化患者血清中的miR-30c-5p和miR-302c-3p表達(dá)增高，可能作為監(jiān)測和診斷丙型肝炎病毒陽性的肝硬化的生物標(biāo)志物。

丙型肝炎病毒；肝硬化；miR-30c-5p；miR-302c-3p

全球約3%的人口已經(jīng)感染丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）。HCV感染一般會誘導(dǎo)慢性肝病，包括慢性丙型肝炎、肝硬化和肝癌，嚴(yán)重影響人類的身心健康［1］。肝癌是常見的惡性腫瘤之一，同時也是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的原因之一［2］。肝癌早期很難被發(fā)現(xiàn)及診斷，所以肝癌一旦被診斷，其患者的生存期往往只有幾個月。幾乎90%的肝癌是由肝硬化發(fā)展而來的。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的慢性感染、飲酒、非酒精性脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎等在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用［3］。HCV是引起急性和慢性肝炎的主要原因。目前臨床上診斷肝硬化主要以臨床及影像學(xué)特征為依據(jù)，尚無確切的分子生物學(xué)標(biāo)記。

作者單位：漢中市中心醫(yī)院感染科，陜西 漢中 713000

通訊作者：張慶，E-mail：drzhangqing@163.com

MicroRNAs（miRNA）是一類由20～25個堿基組成的非編碼的小RNA分子，其在器官發(fā)育、分化、細(xì)胞增值和凋亡中起重要的作用。越來越多的研究表明，miRNA穩(wěn)定存在于血清、血漿、尿液、唾液等體液中［4］。循環(huán)中的miRNA已成為疾病的無創(chuàng)的監(jiān)測指標(biāo)，如肝臟損傷、腎臟損傷、腫瘤等［5］。Zehra Oksuz等［6］首先報道了miR-30c-5p和 miR-302c-3p在HCV陽性肝硬化中表達(dá)降低，可能成為監(jiān)測和診斷肝硬化的生物標(biāo)記物。那么，這些miRNA是否在國人中實(shí)現(xiàn)生物標(biāo)志物的作用？

1　材料和方法

1.1研究對象

選取2014年10月～2015年10月我院感染科住院患者，根據(jù)是否肝硬化分為丙型肝炎組和HCV陽性肝硬化組，其中丙型肝炎患者30例，男19例，女11例，年齡21～67歲，平均年齡（43±8.9）歲；HCV陽性肝硬化患者35例，男20例，女15例，年齡27～65歲，平均年齡（45±10.5）歲。所有患者均接受Real Time-PCR檢測為HCV RNA陽性。對照組為正常健康人的血液，共10例，男6例，女4例，年齡31～58歲，平均年齡（44±8.4）歲，并檢測HCV RNA陰性。實(shí)驗(yàn)組和對照組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組和對照組對象均簽署了知情同意書。

1.2儀器與試劑

ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System（Life公司）。TRIzol購于Invetrigen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Prime miRNA RTPCR檢測試劑盒購自上海生工生物公司；miRNA特異性檢測引物購自上海生工生物公司。

1.3血漿中總RNA提取

血漿中總RNA從200 μl血漿中提取，采用TRIzol方法。（1）200 μl血漿中加入800 μl TRIzol，混勻，加入200 μl三氯甲烷，劇烈震蕩15 sec；（2）4℃12 000 g離心15 min，上清移入去RNA酶EP管，加入500 μl提前預(yù)冷的異丙醇，混勻，室溫靜置15 min；（3）4 ℃12 000 g離心20 min，可見管底白色沉淀，棄上清，加入1 ml 75%的乙醇（DEPC水配制）清洗；（4）4 ℃ 12 000 g離心10 min，棄上清，將RNA干燥5～10 min，加入20 μl DEPC水溶解備用。

cDNA合成及Real Time-PCR。

cDNA合成及Real Time-PCR按照SYBR Prime miRNA RTPCR試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行操作。電腦記錄熔解曲線，采用相對定量法分析目的基因相對表達(dá)量，以 N= 2-??Ct表示??Ct =（CtmiR目的基因-CtU6）-（CtmiR標(biāo)準(zhǔn)-CtU6）。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析

患者的臨床資料采用2-sidedχ2檢驗(yàn)，比較miRNA在丙型肝炎組、肝炎組和對照之間的差異采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件，圖表用GraphPad Prism 5.0。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

慢性丙肝組患者血清miR-30c-5p和 miR-302c-3p表達(dá)高于正常對照組，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；HCV陽性肝硬化組患者血清miR-30c-5p和miR-302c-3p表達(dá)高于正常對照組，兩組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1　miR-30c-5p和 miR-302c-3p在慢性丙型肝炎和HCV陽性肝硬化患者血漿中表達(dá)升高

3　討論

丙型肝炎病毒感染患者約有80%的患者發(fā)展為慢性感染，并且約有20%的患者會在20～30年內(nèi)發(fā)展為肝硬化或肝癌［7］。肝硬化的診斷及早期干預(yù)是預(yù)防肝癌的一種有效方法。因此，對肝硬化的診斷具有重要的臨床意義。血清學(xué)檢測是近年來發(fā)展較快并對肝硬化有一定診斷價值的非創(chuàng)性診斷方法。近年來研究報道，miRNA穩(wěn)定存在于血清、血漿、尿液、唾液等體液中［4］。研究表明，miRNA成為診斷癌癥和其他疾病的新穎生物標(biāo)記物。本研究結(jié)果表明：miR-30c-5p和 miR-302c-3p在慢性丙型肝炎及HCV陽性肝硬化患者中表達(dá)升高。這與Zehra Oksuz等［6］的研究結(jié)果基本一致。

目前，肝硬化中大多數(shù)監(jiān)測標(biāo)記物為蛋白，如透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、 Ⅲ型膠原 N端肽等［8-9］。而蛋白標(biāo)記物有它的缺陷，首先就是特異性和重復(fù)性較差；第二，蛋白標(biāo)記物的監(jiān)測，使得臨床工作檢測復(fù)雜，沒有商品化試劑盒，且蛋白的靈敏度低，不易發(fā)現(xiàn)變化。理想的生物學(xué)標(biāo)記應(yīng)該無創(chuàng)、簡便、快速、準(zhǔn)確。

B超可以通過觀察肝臟形態(tài)的大小、肝臟實(shí)質(zhì)光點(diǎn)形態(tài)和分布，對肝硬化做出判斷，具有無創(chuàng)、直觀、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。也有研究報道B超對肝硬化診斷具有較高的臨床價值［10］。但是，B超只是一個宏觀的觀察表現(xiàn)，并沒有對肝硬化組織進(jìn)行定量分析。

CT可以對肝臟體積及血流灌注進(jìn)行觀察，可以顯示肝臟大小和體積指數(shù)增大，動態(tài)反應(yīng)肝臟纖維化向肝硬化轉(zhuǎn)變的過程及肝臟損害程度的逐漸加劇。核磁共振成像（MR）是將生物力學(xué)與影像學(xué)結(jié)合，是測定肝硬化嚴(yán)重程度的影像學(xué)方法。CT和MR對肝硬化的診斷，尤其是肝纖維化階段的診斷尚處在研究階段，對纖維化的判斷各項指標(biāo)有重疊，距離應(yīng)用于臨床還有一段距離［11］。

綜上所述，miR-30c-5p和 miR-302c-3p在丙型肝炎病毒陽性的肝硬化患者中表達(dá)升高，可以作為監(jiān)測丙型肝炎病毒陽性肝硬化的生物學(xué)標(biāo)志，并具有無創(chuàng)、簡便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

［1］Murakami Y，Tanaka M，Toyoda H，et al. Hepatic microRNA expression is associated with the response to interferon treatment of chronic hepatitis C［J］. BMC Med Genomics，2010，48（3）：1755-1768.

［2］Sposito C，Battiston C，F(xiàn)acciorusso A，et al. Propensity score analysis of outcomes following laparoscopic or open liver resection for hepatocellular carcinoma［J］. Br J Surg.，2016，2（3）：658-672.

［3］Sun J，Lu H，Wang X，et al. MicroRNAs in hepatocellular carcinoma: regulation，function，and clinical implications［J］. Scientific World Journal，2013，32（4）：92-98.

［4］Weber JA，Baxter DH，Zhang S，et al. The microRNA spectrum in 12 body fluids［J］. Clin Chem.，2010，56（11）：1733-1741.

［5］Zen K，Zhang CY. Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and monitor human cancers［J］. Med Res Rev.，2012，32（2）：326-348.

［6］Oksuz Z，Serin MS，Kaplan E，et al. Serum microRNAs， miR-30c-5p，miR-223-3p，miR-302c-3p and miR-17-5p could be used as novel non-invasive biomarkers for HCV-positive cirrhosis and hepatocellular carcinoma［J］. Mol Biol Rep.，2015，42（3）：713-720.

［7］Shrivastava S，Steele R，Ray R，et al. MicroRNAs: Role in Hepatitis C Virus pathogenesis［J］. Genes Dis.， 2015，2（1）：35-45.

［8］程捷瑤，馬紅. 慢性肝病肝纖維化無創(chuàng)診斷的研究進(jìn)展［J］. 臨床肝膽病雜志，2014，30（2）：178-181.

［9］遲太升，張月玲，張健，等. 無創(chuàng)性代償期肝硬化的早期診斷進(jìn)展及防治［J］. 臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2016，3（1）：187-188.

［10］ Tang A，Kim TK，Heathcote J，et al. Does hepatic vein transit time performed with contrast-enhanced ultrasound predict the severity of hepatic fibrosis［J］. Ultrasound Med Biol.，2011，37（12）：1963-1969.

［11］ 謝安，劉建濱. 肝硬化的CT及MRI影像學(xué)評價［J］. 醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（6）：940-942.

New Biomarkers for microRNAs: HCV Positive Liver Cirrhosis in Patients With Plasma

ZHANG Qing LIU Yanbin CAO Pinghu ZENG Xin LIU Jie Department of Infectious Diseases， Hanzhong Central Hospital， Hanzhong Shanxi 713000， China

Objective To discussion serum miRNAs expression levels in patients with HCV-positive cirrhosis. Methods Using real-time quantitative PCR （PCR Real-time） method to detect the expression of miR-30c-5p and miR-302c-3p in the serum of hepatitis C virus and hepatitis C virus positive patients with cirrhosis. Results The expressions of miR-30c-5p and miR-302c-3p is up-regulated in patients with HCV-positive cirrhosis and HCV infection. Conclusion The upregulated expressions of miR-30c-5p， miR-302c-3p may serve as a biomarker for monitoring and diagnosis of HCV-positive cirrhosis.

HCV， Cirrhosis， miR-30c-5p， miR-302c-3p

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.19.026

R735

A

1674-9308（2016）19-0043-03