吳施楠 潘 博 張 曄 王 熙 王 晶 蔣海越 王彬彬*

1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院；4.首都醫(yī)科大學(xué)

HOXA1基因與先天性小耳畸形相關(guān)性研究

吳施楠1,2潘 博3張 曄3王 熙2王 晶4蔣海越3王彬彬1,2*

1. 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院(100730)；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院；4.首都醫(yī)科大學(xué)

目的：研究同源框A1(HOXA1)基因與先天性小耳畸形之間是否存在關(guān)聯(lián)，為小耳畸形的候選基因研究提供線索。方法：在HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中選出HOXA1基因的標(biāo)簽SNP rs17449024，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜在1152例非綜合征型小耳畸形(病例組)及1152例相匹配的健康對(duì)照中對(duì)該SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)HOXA1與小耳畸形之間相關(guān)性。結(jié)果：Rs17449024的等位基因頻率及基因型分布在病例組和對(duì)照組中不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.279、0.186)。在顯性和隱性模型下也未觀察到差異。結(jié)論：在本研究人群中，HOXA1基因與非綜合征型小耳畸形之間不存在關(guān)聯(lián)。還需利用多種方法探究該基因在小耳畸形發(fā)生中的作用。

先天性小耳畸形；HOXA1基因；標(biāo)簽SNP；關(guān)聯(lián)分析研究

小耳畸形是一種顱面部先天性出生缺陷，該病的主要表型特征是小且異常的外耳廓形狀及結(jié)構(gòu)。大多數(shù)患者常伴有外耳道狹窄或閉鎖等，少數(shù)患者會(huì)累及中耳，但內(nèi)耳一般不受影響。小耳畸形表型的變化種類(lèi)較多，輕度患者耳廓結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，僅少數(shù)幾個(gè)耳廓標(biāo)志物消失，重度患者的耳廓結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)，甚至表現(xiàn)為耳廓完全缺失(無(wú)耳畸形)。中國(guó)小耳畸形新生兒總發(fā)病率約為3.06/萬(wàn)，且呈不斷上升的趨勢(shì)[1]。世界范圍內(nèi)，該病新生兒的平均發(fā)病率為2.06/萬(wàn)[2]?？梢?jiàn)我國(guó)小耳畸形的發(fā)病率高于世界平均水平，需引起重視。小耳畸形可單獨(dú)發(fā)生，亦可伴隨其他器官或組織畸形出現(xiàn)，基于此可將小耳畸形分為非綜合征型和綜合征型。常見(jiàn)的綜合征型小耳畸形有LAMM綜合征、Meier-Gorlin綜合征及鰓耳腎(BOR)綜合征等[3]。目前，小耳畸形的致病因素仍不清楚。研究表明，環(huán)境因素、母體因素及遺傳因素都會(huì)導(dǎo)致小耳畸形的發(fā)生[3]。其中遺傳因素在疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用，雙生子研究結(jié)果提示我們，同卵雙胞胎發(fā)生小耳畸形的一致率明顯高于異卵雙胞胎(38.5%比4.5%)，即同卵雙胞胎患有耳部畸形的概率增加了30倍[4]。一些小耳畸形相關(guān)的遺傳學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包括FGF3、ROBO1，EVC、EVC2、SLC2A9、NKX3-2以及HMX1等基因與小耳畸形發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)[5-6]。綜合多個(gè)研究結(jié)果來(lái)看，這些基因目前僅能解釋部分患者的致病因素，在不同的研究人群中得到的結(jié)果不一致，因此小耳畸形的致病基因仍不明確，還需在大樣本中進(jìn)行深入研究。同源框A1(Homeobox A1，HOXA1)是HOX基因家族中的一員，該基因家族在胚胎的早期發(fā)育中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，是一類(lèi)非常重要的調(diào)控基因[7]。多年來(lái)，HOXA1基因一直被認(rèn)為是小耳畸形的一個(gè)重要候選基因[8-9]，但在大樣本量非綜合征小耳畸形患者中進(jìn)行的遺傳學(xué)研究少見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究中對(duì)HOXA1基因的標(biāo)簽SNP(tag SNP)與非綜合征型小耳畸形在大樣本人群中進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析研究，以期發(fā)現(xiàn)該病新的研究思路。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

小耳畸形患者來(lái)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院整形七科，所有患者均進(jìn)行了耳部、顱面部及身體其他部位的嚴(yán)格檢查。納入無(wú)綜合征表型，無(wú)其他慢性或重大疾病的非綜合征型小耳畸形患者1152例作為本研究的病例組。隨后按照整形外科醫(yī)院整形七科多年經(jīng)驗(yàn)建立的分類(lèi)方法[10]將患者按照嚴(yán)重程度進(jìn)行分為I、II、III度，并對(duì)患者的性別、患側(cè)、外耳道受累等情況進(jìn)行記錄。對(duì)照樣本來(lái)自該院體檢中心，將無(wú)任何耳部畸形及其他先天性或慢性疾病的人群，按照性別、民族(全部研究對(duì)象均為漢族)相匹配的原則納入1152例作為對(duì)照組。上述病例組和對(duì)照組中的研究對(duì)象均為不相關(guān)個(gè)體，彼此無(wú)血緣關(guān)系。本研究通過(guò)了國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，所有實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均符合倫理規(guī)定。全部研究對(duì)象均由本人或監(jiān)護(hù)人簽署了知情同意書(shū)，EDTA抗凝管采集血液樣本2ml，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HOXA1基因tag SNP的選擇 在HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中查找HOXA1基因所在染色體的位置，在該位置的基礎(chǔ)上在5'和3'端分別延長(zhǎng)1000bp，并將此區(qū)域(chr7:27098141-27103150)作為挑選tag SNP的范圍。隨后在HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中的tag SNP選擇項(xiàng)欄，設(shè)置選擇CHB， r2>0.8，最小等位基因頻率(MAF)>0.05進(jìn)行選擇。最終得到HOXA1基因的tag SNP(rs17449024)進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)驗(yàn) 利用HiPure Blood DNA Mini Kit全基因組DNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)，從已收集的病例和對(duì)照血液樣本中提取基因組DNA，檢測(cè)各樣本的濃度與純度，按照實(shí)驗(yàn)要求將DNA稀釋至10ng/μl，保證每個(gè)反應(yīng)孔中的DNA濃度相近。將稀釋好的DNA排板待用。利用AssayDesigner3.1 軟件，結(jié)合文獻(xiàn)設(shè)計(jì)反應(yīng)引物。Rs17449024位點(diǎn)的引物如下：1st-PCR引物，ACGTTGGATGTTCAAGCTCGGAATGGAGGG；2nd-PCR引物，ACGTTGGATGTCTTTTCTTGCCCTCGTCTC，產(chǎn)物長(zhǎng)度107bp。根據(jù)規(guī)定的實(shí)驗(yàn)體系加入反應(yīng)試劑及DNA樣本，依次進(jìn)行PCR、SAP純化反應(yīng)及單堿基延伸反應(yīng)，利用MassARRAY 系統(tǒng)(美國(guó)Sequenom公司)進(jìn)行飛行時(shí)間質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，得到rs17449024在每位研究對(duì)象中的分型數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算基因型分布及等位基因頻率的差異，同時(shí)計(jì)算等位基因的OR值及95% CI，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組和對(duì)照組中的哈迪-溫伯格平衡(HWE)利用在線計(jì)算軟件OEGE-HWE calculator(http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml)計(jì)算，P>0.05則滿足該平衡。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的臨床特征

本研究共納入1152例非綜合征型小耳畸形患者，其中I度192例，II度919例，III度(包括無(wú)耳畸形)41例，年齡為11.26±6.57歲；對(duì)照組年齡49.89±17.22歲。病例組和對(duì)照組中男女性別比例無(wú)差異(df=1，P=1.00)。病例組中男性患者比例是女性患者的3.2倍，多數(shù)患者是右側(cè)受累。患者的外耳道大都有不同程度的狹窄或閉鎖，見(jiàn)表1。

2.2 HOXA1基因tag SNP與非綜合征型小耳畸形的關(guān)聯(lián)

根據(jù)得到的基因分型數(shù)據(jù)可知，rs17449024位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中的分型率分別為99.22%和99.65%，均高于99%，分型成功，結(jié)果可信。病例組和對(duì)照組中的基因型分布滿足哈迪-溫伯格平衡，在OEGE上計(jì)算出的P>0.05。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，rs17449024的等位基因頻率及基因型分布在病例組和對(duì)照組中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值分別為0.279和0.186。隨后又分別在顯性和隱性模型下對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，也未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表2。

表1 兩組對(duì)象的臨床資料[例(%)]

表2 HOXA1 tag SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型分布

3 討論

本研究是國(guó)內(nèi)外首次在大樣本量的非綜合征型小耳畸形患者中對(duì)HOXA1基因與非綜合征型小耳畸形的相關(guān)性進(jìn)行探討。結(jié)果表明HOXA1基因的tag SNP rs17449024的基因型分布和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明在本研究人群中，HOXA1基因與非綜合征型小耳畸形不相關(guān)，該基因在小耳畸形的發(fā)生發(fā)展中的作用仍需多方面探討。

本次納入研究的非綜合征型小耳畸形病例有1152例，從流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，本研究中病例組中的男女比例高達(dá)3.2:1，這一數(shù)值與中國(guó)兩項(xiàng)研究得到的結(jié)果相近(72.75%和69.7%)[11-12]，但比芬蘭(60.6%)、荷蘭(60.8%)及韓國(guó)(56.6%)等地的男性比例高[13-15]。外耳道受累的患者比例(99.65%)也顯著高于其他研究結(jié)果[13，16]。通過(guò)比較可知，我國(guó)小耳畸形男性患者比例、外耳道受累患者比例普遍高于其他國(guó)家，這也說(shuō)明人群、地域等因素均會(huì)對(duì)小耳畸形造成影響。另外由于部分研究的時(shí)間較早，得到的數(shù)據(jù)與目前的流行病學(xué)數(shù)據(jù)可能存在出入。

HOXA1基因?qū)儆贖OX基因家族中的HOXA簇，該家族編碼的蛋白在胚胎早期發(fā)育及細(xì)胞增殖、分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。HOXA1在胚胎早期第一、 二鰓弓部位的神經(jīng)嵴細(xì)胞中有表達(dá)，而從發(fā)育生物學(xué)角度來(lái)看，中、外耳即是由第一、二鰓弓發(fā)育而來(lái)，這提示HOXA1可能是外耳發(fā)育中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。早在20世紀(jì)90年代，研究人員就在Hoxa1純和缺失的小鼠模型中觀察到，該基因缺失的小鼠外耳發(fā)育明顯異常，耳廓大小異于正常小鼠，且中耳和內(nèi)耳的發(fā)育和功能也受到影響[18-19]。Hoxa1 /Hoxb1 復(fù)合突變體小鼠則表現(xiàn)為無(wú)耳畸形，無(wú)外耳道，且在第10.5天時(shí)觀察不到第二鰓弓[20]。但HOXA1基因在大規(guī)模的非綜合征型小耳畸形人群中的遺傳學(xué)研究較少，多集中在綜合征研究，Tischfield，Bosley等人在臨床表現(xiàn)包括畸形耳廓，如位置低下、耳輪扁平等在內(nèi)的綜合征患者中檢測(cè)到了HOXA1的多個(gè)突變[21-22]。但由于HOXA1的保守性很強(qiáng)，在具有耳廓畸形的DRS綜合征中，多項(xiàng)研究均未發(fā)現(xiàn)HOXA1突變[23-25]。與此結(jié)果相似，Alasti等人[26]在一個(gè)伊朗近親小耳畸形家系中也并未檢測(cè)到HOXA1的突變，而是在其同源的HOXA2基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)錯(cuò)義突變。喬瑞敏[27]在家豬模型中通過(guò)芯片掃描及測(cè)序確認(rèn)HOXA1突變能夠解釋豬耳大小，隨后在146例散發(fā)小耳畸形中檢測(cè)到了該基因的一個(gè)缺失突變，這是目前國(guó)內(nèi)僅有的一項(xiàng)針對(duì)HOXA1基因進(jìn)行突變篩查得到陽(yáng)性結(jié)果的研究。

通過(guò)與上述這些研究的樣本及結(jié)果相比較，結(jié)合本研究的數(shù)據(jù)結(jié)果，可以看出HOXA1基因與本研究中的非綜合征型小耳畸形人群不存在相關(guān)性。一方面由于本研究中的患者來(lái)自全國(guó)各地，且絕大部分樣本都是散發(fā)的，地域差異等非遺傳因素均會(huì)對(duì)研究結(jié)果造成一定影響，使得HOXA1基因的遺傳作用在本研究中未被發(fā)現(xiàn)。另一方面考慮到小耳畸形的發(fā)病過(guò)程復(fù)雜，從外耳發(fā)育的過(guò)程來(lái)講，第一、二鰓弓及神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖、分化、遷移等過(guò)程受多個(gè)信號(hào)分子或基因的調(diào)控，HOXA1可能不是導(dǎo)致小耳畸形唯一的致病基因。因此在本研究人群中，未發(fā)現(xiàn)該基因與非綜合征型小耳畸形相關(guān)。從多項(xiàng)研究結(jié)果可以看出，目前得到的候選基因，如EVC、EVC2、HOXA2等[6，26]，多來(lái)自于家系連鎖分析或突變篩查?；谶@些研究現(xiàn)狀及我們的分析結(jié)果，為了進(jìn)一步探究HOXA1在小耳畸形發(fā)病中的作用，后續(xù)我們可以從非綜合征小耳畸形的家系研究入手，重點(diǎn)進(jìn)行家系中關(guān)聯(lián)分析研究或HOXA1的突變篩查研究，繼續(xù)深入探討HOXA1基因與小耳畸形之間的關(guān)聯(lián)，為小耳畸形的遺傳學(xué)及致病基因的研究提供更多依據(jù)。

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[責(zé)任編輯：董 琳]

Association study between HOXA1 gene and congenital microtia

WU Shinan1,2, PAN Bo3, Zhang Ye3, WANG Xi2, WANG Jing4, JIANG Haiyue3, WANG Binbin1,2

1.GraduateSchoolofPekingUnionMedicalCollege,Beijing, 100730；2.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning; 3PlasticSurgeryHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege; 4TheCapitalMedicalUniversity,Beijing

*Correspondingauthor:wbbahu@163.com

Objective: To explore whether HOXA1 gene associated with congenital microtia and to provide clues for candidate gene study of microtia. Methods: One tag SNP (rs17449024) of HOXA1 was selected from Hapmap database, and genotyping were detected by using Time of Flight Mass Spectrometry (TOF MS) in 1152 nonsyndromic microtia patients and 1152 healthy controls. The association between HOXA1 and microtia was analyzed by chi-square test. Results: There was no significant difference in allele frequency and genotypic distribution of rs17449024 between patients in observation group and control group (Pvalue was 0.186 and 0.276, respectively). Significant differences were not observed in both recessive and dominant modes. Conclusion: The results showed that HOXA1 gene is not associated with nonsyndromic microtia. So other various methods were further used to explore the role of HOXA1 gene in nonsyndromic microtia patients.

Congenital microtia; HOXA1 gene; Tag SNP; Association study

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81571863，81272124)；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床科研合作課題(編號(hào)：13JL22)

2016-05-16

2016-06-02

10.3969/j.issn.1004-8189.2016.

*通訊作者：wbbahu@163.com