陳西華 賀 斌 王尚明 王 寧 張 斌 張樹成 徐祥波

國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所 (北京，100081)

·基礎研究·

益母草堿對小鼠生理性月經樣模型崩解期的作用

陳西華 賀 斌 王尚明 王 寧 張 斌 張樹成 徐祥波*

國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所 (北京，100081)

目的：研究益母草堿對小鼠生理性月經樣模型的作用。方法：建立小鼠生理性月經樣模型，將人工蛻膜化的假孕小鼠雙側卵巢切除，引發(fā)孕酮(P4)撤退，隨后蛻膜化子宮內膜發(fā)生崩解壞死，模型小鼠出現(xiàn)月經樣出血。在P4撤退前至撤退后24h，給予模型小鼠益母草堿，觀察P4撤退后小鼠陰道出血狀態(tài)，子宮大體形態(tài)以及組織形態(tài)學變化。結果：模型小鼠均在P4撤退后12～24h觀察到陰道出血。與空白對照組相比，P4撤退后24h益母草堿藥物處理組小鼠子宮顏色較深，子宮充血較顯著。小鼠子宮腔上皮下的血管顯著擴張，特別是腔上皮下血管擴張與紅細胞滲出嚴重，且范圍較對照組更廣。通過統(tǒng)計學分析證實，益母草堿組充血面積高于對照組(P=0.011)。結論：提示益母草堿可導致小鼠子宮內血管擴張與紅細胞滲出，其中的藥理作用和分子機制有待進一步研究。

活血化瘀；益母草堿；出血；孕酮撤退；月經樣模型

益母草常用于治療藥物流產后子宮異常出血和月經不調，療效確切，效果顯著[1]。中醫(yī)認為益母草具有活血祛瘀，調經消水之功效。益母草的藥理作用和它所含生物堿密切相關，如益母草堿、水蘇堿、益母草啶和益母草寧等。其中，益母草堿是益母草特有的生物堿，近年來受到研究者的廣泛關注，但其藥理作用與分子機制及在月經中的作用尚不清楚。本研究建立的小鼠月經樣模型是月經研究的良好平臺[2-3]，本研究利用其模型初步探索益母草堿對月經的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與實驗材料

SPFII級成年(13w)NIH小鼠，雄鼠與雌鼠各10只(國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所實驗動物中心提供)。小鼠在可控的條件下給予充足的水和食物飼養(yǎng)(光照6:00 ～ 18:00、溫度21±1℃)。所有實驗程序均獲得國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所動物倫理委員會審查批準。益母草堿(陜西森弗高科實業(yè)有限公司)，花生油(魯花)，常規(guī)石蠟切片HE染色試劑等。

1.2 小鼠月經樣模型的建立[3]

將雌鼠與結扎輸精管的雄鼠進行交配，次日中午12:00見栓記為0.5d，獲得假孕雌鼠。48h后(2.5d)，小鼠子宮宮腔內注射15μl花生油誘導子宮內膜發(fā)生蛻膜化。蛻膜化誘導48h后(4.5d)，將小鼠雙側卵巢切除，引發(fā)孕酮(P4)撤退，此時計為P4撤退0h；在接下來的48h內，小鼠子宮內膜發(fā)生崩解出血，從宮腔脫落并由陰道排出；隨后，子宮內膜逐漸修復，直至48h子宮腔上皮被覆完全。在P4撤退的0～24h子宮內膜蛻膜化細胞逐漸壞死，至24h崩解程度最高，定義為崩解期。

1.3 分組與處理

將月經樣模型小鼠分為益母草堿藥物處理組(益母草堿組)與空白對照組(對照組)。每個益母草堿組與對照組小鼠數(shù)量均不少于5只。益母草堿組小鼠從P4撤退前48h 12:00開始，間隔6h，分12次進行腹腔注射給藥(給藥劑量30mg/kg/次)。對照組小鼠以同樣的方式腹腔注射等體積生理鹽水。益母草堿組與對照組小鼠均在P4撤退后12h、16h與24h，進行陰道細胞學涂片觀察陰道出血，P4撤退后24h處死取材。未發(fā)生顯著出血的模型小鼠為誘導蛻膜化失敗被剔除。

1.4 小鼠子宮觀察與統(tǒng)計學分析

小鼠子宮取材后用4%多聚甲醛制固定24h后，制成常規(guī)石蠟切片，進行常規(guī)HE染色和組織觀察形態(tài)學觀察。利用圖像處理軟件，分別統(tǒng)計小鼠子宮橫切切片中蛻膜化組織面積，充血區(qū)域的面積，計算充血區(qū)域在蛻膜化組織中所占比例。將對照組與益母草堿組中每個樣本的相對充血面積進行統(tǒng)計學分析，計算標準差并進行t檢驗。

2 結果

2.1 兩組小鼠子宮形態(tài)及組織形態(tài)學觀察

益母草堿組與對照組小鼠均在12～24h觀察到出血，16h與24h出血量最大。在P4撤退后24h，對照組小鼠子宮大體形態(tài)較粗呈暗紅色(圖1 A)。小鼠子宮組織切片HE染色觀察，子宮內膜蛻膜化區(qū)域細胞大部分為陳舊性壞死，絕大多數(shù)細胞核固縮，細胞質完全溶解，無法辨別細胞界線，紅細胞滲出，壞死的子宮內膜與宮腔有明顯的分離帶。蛻膜化的子宮內膜脫落后，基底層無上皮被覆，呈裸露狀態(tài)(圖1 D，G)。小鼠月經樣模型給予益母草堿后，其子宮大體呈暗紅色，較對照組顏色更深，且充血明顯(圖1 B，C)，其核固縮、細胞凋亡等崩解表型與對照組相似(圖1 E，F(xiàn))。但與對照組相比，益母草堿組子宮內膜中血管擴張與紅細胞滲出程度明顯增強，特別是子宮腔上皮下的血管擴張顯著，且擴張的血管中可見大量的紅細胞(圖1 H，I)。對照組5只小鼠中僅有1只呈現(xiàn)血管擴張現(xiàn)象，而益母草堿組5只小鼠均有顯著的血管擴張現(xiàn)象。

2.2 益母草堿對子宮內膜充血程度的影響

相對充血面積見圖2A。對照組相對充血面積為5.08±3.78%，其中多數(shù)<5%，僅一只小鼠樣本>10%；益母草堿組為13.97±4.70%，絕大多數(shù)相對充血面積>10%，最高達到20%(圖2B)。將以上數(shù)據(jù)進行t檢驗，益母草堿組小鼠子宮充血程度高于對照組(P=0.011)。

3 討論

月經不調是婦科常見病，嚴重影響和制約女性工作和生活。目前西醫(yī)主要以雌、孕激素調整月經周期及促排卵的方法治療月經不調[4]。而中醫(yī)治療月經不調的歷史由來已久，且副作用小。益母草是中醫(yī)臨床治療中用于活血化瘀的常用藥，可治療月經不調、產后瘀痛。生物堿被認為是益母草的有效成分[5]。本研究對益母草堿在月經發(fā)生中的作用進行了初步探索。

A：對照組子宮大體 D：組織形態(tài)低倍圖 G：子宮局部放大高倍圖 B、C：益母草堿組子宮大體 E、F：組織形態(tài)低倍圖 H、I：局部放大高倍圖 (D，E，F(xiàn)圖中方框區(qū)域的放大圖分別為G，H，I)

圖1 對照組與益母草堿組子宮大體形態(tài)與組織形態(tài)學觀察

A：相對充血面積 B：益母草堿組相對充血面積顯著高于對照組(*P= 0.011)

圖2 對照組與益母草堿組相對充血面積計算與統(tǒng)計學分析

現(xiàn)代醫(yī)學研究顯示，益母草制劑能夠治療藥物流產后出血與月經恢復，療效顯著。口服益母草膠囊能夠縮短人工流產術后患者月經恢復時間，縮短陰道持續(xù)出血時間，且未發(fā)現(xiàn)不良反應[6-8]，益母草堿施予藥物流產后出血患者也具有良好的預后效果[9]。益母草堿治療流產后癥狀的作用機制在動物研究中得到闡釋。李霞等[10]利用大鼠藥物流產模型給予益母草堿發(fā)現(xiàn)，益母草堿能減少子宮出血量，縮短出血時間，明顯減少宮內滯留物，增強子宮收縮活動。此外，在原發(fā)性痛經臨床治療中，益母草顆粒治療組治療效率顯著高于對照組[11]。研究顯示[12]，益母草堿能提高血清中雌二醇水平，還可通過提高大鼠下丘腦促性腺激素釋放激素的表達，促進黃體生成素和卵泡激素分泌，從而上調子宮中雌二醇受體mRNA的表達，進一步加強對子宮內膜的修復。以上結果說明，益母草堿可從多個方面顯著促進人工流產后子宮內膜的修復與再生。

本研究利用小鼠月經樣模型探索益母草堿在月經發(fā)生中對子宮內膜的作用。結果顯示，在小鼠月經樣模型崩解期給予益母草堿后，子宮內膜腔上皮下擴張的血管的數(shù)量與擴張程度增加，并有大量紅細胞滲出。由此提示，益母草堿可能通過改變血管內皮細胞的通透性，引起血管擴張與紅細胞彌散。該現(xiàn)象在此前的流產動物模型研究中未觀察到。益母草堿在月經發(fā)生中的藥理作用和分子機制還有待進一步研究。

[1] Wojtyniak K, Szymanski M, Matlawska I. Leonurus cardiaca L. (motherwort): a review of its phytochemistry and pharmacology[J]. Phytother Res, 2013, 27(8): 1115-1120.

[2] Xu X B, He B, Wang J D. Menstrual-like changes in mice are provoked through the pharmacologic withdrawal of progesterone using mifepristone following induction of decidualization.[J]. Hum Reprod, 2007, 22(12): 3184-3191.

[3] 曹惠子，徐祥波，陳西華等. 利用假孕小鼠建立小鼠行經模型的研究[J]. 生殖醫(yī)學雜志, 2010, 19(1): 35-39.

[4] 齊瑞文. 中醫(yī)治療婦科月經不調的臨床探析[J]. 中國社區(qū)醫(yī)師, 2015(14): 91-92.

[5] 賀春暉，趙懿清，李霞等. 益母草堿藥理作用的分子機制研究進展[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2013(12): 1419-1423.

[6] 陳辰，胡小榮. 鮮益母草膠囊用于人工流產術后療效觀察[J]. 北方藥學, 2014(01): 28-29.

[7] 王倩倩，杜煒杰. 鮮益母草膠囊對人工流產術后臨床效果分析及月經恢復情況觀察[J]. 中華中醫(yī)藥學刊, 2015(01): 249-251.

[8] 王曉茹. 益母草膠囊用于藥物流產后的臨床療效觀察[J]. 吉林醫(yī)學, 2014(31): 6979-6980.

[9] 黃霞. 研究分析藥物流產后出血患者實施益母草堿的預后效果[J]. 中國衛(wèi)生產業(yè), 2014(24): 187-188.

[10] 李霞，陳飛虎，袁鳳來等. 益母草堿對藥物流產后大鼠子宮的作用研究[J]. 中國臨床藥理學與治療學, 2009(05): 481-486.

[11] 王利分. 益母草顆粒治療原發(fā)性痛經的臨床效果分析[J]. 中國農村衛(wèi)生事業(yè)管理, 2014(09): 1133-1135.

[12] 趙懿清，李霞. 基于下丘腦-垂體-卵巢軸研究鹽酸益母草堿對藥物流產后子宮異常出血作用機制的實驗研究[J]. 蘇州大學學報(醫(yī)學版), 2011(04): 564-568.

[責任編輯：董 琳]

The effect of Leonurine on endometrium break down in physiological menstrual like model mouse

CHEN Xihua, HE Bin, WANG Shangming, WANG Ning, ZHANG Bin, ZHANG Shucheng, XU Xiangbo*

NationalResearchInstituteforFamilyPlanning,Beijing,10081

*Correspondingauthor:xiangboxuhappy@126.com

Objective: To study the effect of Leonurine hydrochloride (Yimucao) on physiological menstrual like model mouse. Methods: The menstrual like model mouse was established as follow, the artificially decidualized pseudopregnant female mice were

bilateral ovariectomy to trigger progesterone (P4) withdrawal, which resulted in endometrium breakdown, and the model mice appeared physiology menstruation. Leonurine was administrated to the model mouse from P4 withdrawal before to 24 hours after, so that the changes of mouse vaginal bleeding, general morphology and histomorphometry were observed. Results: Vaginal bleeding was observed in all mouse models from 12 to 24h after P4 withdrawal. At 24 hours, in Leonurine group, the uteri of mice were darker, and hyperemias of uteri were heavier than those in control group. Vasodilation in the endometrium breakdown area of the uterus was observed after Leonurine delivery, especially the area surrounding the luminal epithelium, which extended much wider compared to mice in control group. Statistical analysis further confirmed the relative hyperemia area was significantly higher in Leonurine group(P= 0.011). Conclusion: Leonurine hydrochloride is able to increase endometrial vasodilation and erythrocyte diapedesis in physiological menstrual like model mouse, however its pharmacological effect and functional mechanism need to be further explored.

Circulation promoting and stasis removing; Leonurine; Bleeding; Progesterone withdrawal; Menstrual like model mouse

2015-11-20

2016-05-12

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.07

*通訊作者：xiangboxuhappy@126.com