陳苗苗，董金杰，杜平

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

低血清培養(yǎng)的BHK21細胞染色體遺傳穩(wěn)定性分析

陳苗苗，董金杰，杜平

(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅 蘭州 730046)

目的:分析1種商業(yè)化的低血清培養(yǎng)基適應BHK21細胞進行傳代培養(yǎng)，該細胞染色體的變異穩(wěn)定性，以判定其質量。方法:采用直接法制取4個代次的BHK21細胞的染色體標本，用常規(guī)Giemsa染色，1 000倍光學顯微鏡下計數(shù)中期分裂相染色體數(shù)目，求出染色體變異率(%)，并進行核型分析。結果:BHK21為亞二倍體或亞四倍體細胞系，亞二倍體眾數(shù)為42，亞四倍體細胞眾數(shù)為72～74，該細胞系染色體的畸變率在各代次所占的比例為0～2%，均較低。結論:用商業(yè)化的低血清培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)BHK21細胞，逐漸降低培養(yǎng)液中血清含量，進行傳代培養(yǎng)，通過選取不同代次細胞的染色體進行核型分析，該細胞系的遺傳學特性相對穩(wěn)定，各代次間無本質差異，可候選為制苗用細胞。

低血清;BHK21細胞;染色體;遺傳穩(wěn)定性

BHK21是源于幼倉鼠腎的一種傳代細胞系［1，2］。由于BHK21細胞對口蹄疫病毒敏感，且又是口蹄疫病毒很好的宿主細胞，所以在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中，都使用BHK21細胞對口蹄疫病毒進行繁殖。無論是傳統(tǒng)的轉瓶工藝還是懸浮培養(yǎng)工藝，都以貼壁的BHK21細胞為馴化對象，由權威機構的ATCC保存的BHK21細胞，在其介紹中明確說明，此傳代細胞遺傳上具有一定的變異性。為了能夠保證口蹄疫病毒生產(chǎn)的高效性，保證宿主細胞的遺傳穩(wěn)定性則是重中之重。目前能夠檢測細胞變異系數(shù)的有效方法就是核型分析，這是細胞遺傳學及細胞生物學的核心基本技術之一。這一技術可以用于研究細胞和組織及個體的特異性鑒定、遺傳變異、種屬進化關系。

目前醫(yī)院常采用外周血、骨髓、羊水制備染色體用于診斷染色體上的疾病［3，4］，很少有文獻介紹傳代細胞的核型分析技術。然而傳代細胞具有馴化成熟、人為控制性強的特點，在實際科研、檢驗、疫苗生產(chǎn)以及生物制品研發(fā)等領域中被廣泛應用，所以傳代細胞的核型分析也顯得十分重要。本研究以低血清培養(yǎng)適應的BHK21細胞進行傳代培養(yǎng)，染色體標本制備的標準參考翁炳煥等［5］提出的考評標準，其中［6］可分析分裂相的要求為數(shù)目明確、全部染色體集中但不重疊、染色體伸展適度，著絲粒清晰、染色清晰，取4個代次400個中期分裂相的染色體進行分析，判定該細胞系的畸變率，以此為依據(jù)篩選優(yōu)良的細胞株。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 主要試劑:秋水仙素、卡諾氏固定液、固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)、吉姆薩染色液、25 g/L胰蛋白、胎牛血清、KCL。

1．1．2 細胞:BHK21細胞:購自中國獸藥監(jiān)察所，由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司質量保證部保存，按常規(guī)組織培養(yǎng)法進行培養(yǎng)和傳代。

1．1．3 培養(yǎng)基:MEM細胞培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，MEM SLM低血清細胞培養(yǎng)基為北京清大天一生物技術有限公司產(chǎn)品，新生牛血清為蘭州民海生物技術公司產(chǎn)品。

1．2 方法

圖1 F4(201培養(yǎng)液+10%血清)細胞形態(tài)圖

1．2．1 細胞培養(yǎng):將復蘇的BHK21細胞在T75的培養(yǎng)瓶中適應低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)32代，其中F1～F8代為傳統(tǒng)201培養(yǎng)液+10%血清培養(yǎng)的BHK21細胞，F(xiàn)9～F16代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+5%血清培養(yǎng)的BHKL21細胞，F(xiàn)17～F25代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+4%血清培養(yǎng)的BHKL21細胞，F(xiàn)26～F32代為商業(yè)化低血清培養(yǎng)基+3%血清培養(yǎng)的BHKL21細胞，細胞馴化過程中，每個代次BHK21細胞長勢穩(wěn)定，形態(tài)良好。馴化穩(wěn)定的4個代次F4、F9、F18、F27 BHK21細胞48 h培養(yǎng)形態(tài)分別見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖2 F9(MEM SLM+5%血清)細胞形態(tài)圖

圖3 F18(MEM SLM+40%血清)細胞形態(tài)圖

圖4 F27(MEM SLM+3%血清)細胞形態(tài)圖

1．2．2 染色體標本制備:參照《四種動物傳代細胞染色體遺傳變異率分析》中染色體標本制備的方法，將5代、10代、20代、30代作為細胞染色體分析的代次，于細胞終止培養(yǎng)前5～6 h，在細胞培養(yǎng)物中加入適量的秋水仙素溶液，使秋水仙素的最終濃度為0．01 μg/mL培養(yǎng)液，以便阻止細胞有絲分裂至中期，到培養(yǎng)結束時，傾棄培養(yǎng)液加入適量25 g/L胰蛋白酶消化液對細胞單層進行消化，收集細胞，再加入預熱至37℃的75 mmol/L KCL溶液5～6 mL，室溫下低滲30 min，離心傾棄上清液，然后加入固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)5 mL固定30 min后，離心10 min(800～1 000 r/min)，重復固定1次，置于4℃過夜，次日離心傾棄上清液，沉淀加1 mL新配的固定液制成細胞懸浮液，在冰水浸泡的干凈玻片上滴加細胞懸浮液3～4滴，室溫下晾干，即制成培養(yǎng)細胞有絲分裂中期的染色體玻片標本。

1．2．3 染色體的Giemsa染色［7］:染色體玻片標本可于室溫下放置1周，或37℃干燥2～4 h后，即可作染色體的Giemsa染色，用pH 6．8的磷酸鹽緩沖液配成100 g/L的Giemsa染色液，滴在染色體玻片標本上，染色30 min，蒸餾水沖洗干凈，晾干。

1．2．4 染色體的觀察與分析:每個代次選擇100個中期分裂相細胞，油鏡(10×100)下計數(shù)染色體數(shù)目，并觀察記錄畸變?nèi)旧w，計算出染色體的畸變率，每種血清含量培養(yǎng)的細胞選擇1個分裂良好的的中期分裂相拍攝顯微照片，并作核型分析。

2 結果與討論

共計數(shù)了BHK21細胞系的5、10、20、30代次，400個中期分裂相的染色體，染色體數(shù)目分布見表1。

表14 個代次染色體數(shù)目分布

從表1染色體的數(shù)目分布可以看出，BHK21屬于亞二倍體和亞四倍體系，5、10、30代次主要是亞二倍體細胞系，其中亞二倍體細胞(染色體數(shù)目32～67)所占的比例分別為76%、80%、79%，亞四倍體細胞(染色體數(shù)目為68～87)，所占比例分別為23%、20%、20%。20代主要是亞四倍體細胞(染色體數(shù)目為68～87)，所占比例為68%。染色體的畸變率在各代次所占的比例為0～2%，染色體畸變率很低。因此，該細胞經(jīng)馴化，用低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，不同的血清用量、各代次之間無本質差異，遺傳學特性相對穩(wěn)定，可候選為制苗用細胞。4個代次各1個細胞中期分裂相圖分別見圖5、圖6、圖7、圖8。

圖5 F5代(201培養(yǎng)液+10%血清)細胞中期分裂相

圖6 F10代(MEM SLM+5%血清)細胞中期分裂相

圖7 F20代(MEM SLM+4%血清)細胞中期分裂相

圖830 (MEM SLM+3%血清)細胞中期分裂相

［1］Umene K，Nishimoto T．Replication of herpes simplex virustype 1 DNA is inhibited in a temperature－sensitive mutant of BHK－21 cells lacking RCC1(regulator of chromo-some condensation)and virus DNA remains linear［J］．J Gen Virol，1996，77(10):2261－2270．

［2］Slam MQ，Islam K，Levan G，et al．Monochromosome transfers to syrian hamster BHK cells via microcell fusion provide functional evidence for suppressor genes on human chromosome 9 both for anchorage independence and for tumorigenicity［J］．Genes Chromosomes Cancer，1995，13(2):112－115．

［3］張桂林，衛(wèi)小靜，鄭梅玲．918例孕中期羊水細胞染色體核型分析［J］．中華醫(yī)學遺傳學雜志，2012，29(1):102－104．

［4］張旺東，王秋菊．染色體核型分析在白血病分型診斷和預后判斷中的臨床意義［J］．國際檢驗醫(yī)學雜志，2010，31(12):1359－1363．

［5］翁炳煥，任宇珂，朱瑞建，等．染色體制備及核型分析室內(nèi)控制標準及其考評標準的探討［J］．中國產(chǎn)前診斷雜志，2013，5(2):40－44．

［6］黃燕，陳紹坤．動物骨髓細胞染色體標本制備失敗的原因分析［J］．生物學通報，2006，42(1):52－54．

［7］郭健民，張耀平，劉瑞清，等．常用實驗動物腫瘤染色體的研究［J］．遺傳學報，1980，7(4):376－381．

The Chromosome Genetic Stability Analysis of BHK21 Cells with Low Serum Culture

Chen Miaomiao，Dong Jinjie，Du Ping
(China Agricultural VET．BIO．Sciece and Technology co．，LTD，Lanzhou Gansu 730046，China)

Objective to determine the quality of a commercial low serum medium，which is adapted to BHK21 cells for subculture．Methods Chromosome samples from four BHK21 cells were obtained by direct method．Using conventional Giemsa staining，the number of metaphase mitotic chromosomes was counted by 1 000 times optical microscope．Find out the rate of chromosome mutation，and karyotype analysis．Result:BHK21 is a sub sub diploid or tetraploid cell line，hypodiploid mode was 42，hypotetraploid cell mode was 72～74．The chromosome aberration rate of the cell line was 0～2%，which was lower than that of the generation．Conclusion domestication and culture of BHK21 cells with commercial low serum medium．To gradually reduce the content of serum in the culture medium．Passage culture．By selecting the chromosome of different generations of cell karyotype analysis，the genetic characteristics of the cell line is relatively stable，there is no essential difference between the generations，can be used as a candidate for the production of cells．

Low Serum;BHK21;Chromosome;Genetic Stability

Q813．1+1

A

1007－1474(2016)04－0009－04

2016－05－27

國家高新技術研究發(fā)展計劃(“863”計劃2011AA10A211)

陳苗苗(1980—)，女，碩士，助理研究員，主要從事生物制品研發(fā)工作。E－mail:wuyuedexuecmm@163．com