施 健張克進(jìn)繆 旭林 樺劉宏斌楊 揚(yáng)

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·論著·

Caspase-3在皮膚鱗狀細(xì)胞癌及光線性角化病中的表達(dá)

施 健1張克進(jìn)2繆 旭1林 樺1劉宏斌3楊 揚(yáng)1

目的： 檢測(cè)Caspase-3在皮膚鱗狀細(xì)胞癌及光線性角化病組織中的表達(dá)。方法： 應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)16例皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損、27例光線性角化病皮損及24例正常皮膚組織中Caspase-3蛋白的表達(dá)。結(jié)果： Caspase-3在皮膚鱗狀細(xì)胞癌、光線性角化病及正常皮膚組織的表達(dá)率分別為37.50%，51.85%，79.17%，其表達(dá)含量在皮膚鱗狀細(xì)胞癌、光線性角化病、正常皮膚組織逐漸增加。結(jié)論： Caspase-3蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與皮膚鱗狀細(xì)胞癌及光線性角化病的發(fā)病過程。

Caspase-3； 皮膚鱗狀細(xì)胞癌； 光線性角化病

光線性角化病（AK）又稱日光性角化病，是因長(zhǎng)期紫外線照射而發(fā)生的一種癌前期病變［1］。目前一種新的定義認(rèn)為AK是一種皮膚原位癌，國(guó)外有報(bào)道指出未予治療的AK可發(fā)展為侵襲性皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC），但演變過程的原因和機(jī)制尚不明確。有研究表明凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，Caspase-3是細(xì)胞凋亡通路中重要的執(zhí)行者，其表達(dá)異?？梢鸺?xì)胞凋亡和增殖異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤等多種疾病的發(fā)生［2］。但目前有關(guān)Caspase-3在皮膚SCC及AK發(fā)生發(fā)展中的報(bào)道較少見。筆者通過檢測(cè)Caspase-3蛋白在皮膚SCC及AK中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討凋亡蛋白Caspase-3在AK及皮膚SCC發(fā)病過程中所起的作用提供可能的理論參考。

1　材料與方法

1.1材料 石蠟包埋組織標(biāo)本來自南通市第一人民醫(yī)院皮膚科2005年1月至2013年12月經(jīng)皮膚病理確診的患者。SCC 16例，年齡（75.13±8.22）歲，其中男7例，女9例；病程3個(gè)月～6年；皮損部位：頭面部14例，軀干1例，四肢1例。AK 27例，年齡（70.04± 11.43）歲，其中男9例，女18例；病程6個(gè)月～11年；皮損部位：頭面部25例，軀干1例，四肢1例。正常對(duì)照組織24塊取自2014年我科皮膚外科手術(shù)中修整遺棄后的正常組織，年齡（66.71±15.45）歲，其中男12例，女12例；取材部位：頭面部15例，軀干3例，四肢6例。三組在年齡、性別及部位之間均具有可比性（P＞0.05）。

1.2主要試劑 Caspase-3兔抗人多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，稀釋工作濃度為1∶80，Envision法檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將標(biāo)本于4%甲醛中固定，石蠟包埋，采用LAB VISION 2D全自動(dòng)免疫組化染色儀、ELIVISION二步法進(jìn)行免疫組化染色。操作要點(diǎn)如下：所需蠟塊切成厚度為4 μm的薄片，載玻片要防止脫片：經(jīng)洗滌劑浸泡8～24 h，流水沖洗過夜，蒸餾水漂洗2次，浸泡于95%酒精中過夜，蒸餾水洗2次，將載玻片排列整齊烘干，經(jīng)POLY-L防脫片處理。置于67℃烘箱當(dāng)中烘片2 h，脫蠟脫水。PBS沖洗，抗原修復(fù)用檸檬酸鹽緩沖液，微波爐中火處理10 min，流水自然冷卻。處理完畢后放入自動(dòng)免疫組化染色儀中，編程。每張切片加1滴3%的H2O2，室溫下孵育10 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加1滴一抗，在室溫條件下孵育1 h，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑，室溫下孵育20 min，PBS沖洗；除去PBS，每張切片加1滴抗鼠/兔聚合物，室溫下孵育30 min，PBS沖洗；除去PBS液，每張切片加一滴新鮮配制的DAB，室溫條件下顯色5 min，蒸餾水沖洗。此過程均在自動(dòng)免疫組化染色儀當(dāng)中按照事先編好的程序完成。從自動(dòng)免疫組化染色儀中取出已染色完畢的切片，蘇木素復(fù)染，0.1%HCL分化，自來水沖洗，藍(lán)化，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。用已知陽(yáng)性標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗和二抗作為空白對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷 組織學(xué)上按照Eneroth等對(duì)高分化和低分化鱗癌的形態(tài)學(xué)描述進(jìn)行分類。Caspase-3陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃染色為陽(yáng)性，顯微鏡下隨機(jī)檢測(cè)5個(gè)獨(dú)立高倍鏡視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行，以平均每100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞的百分比計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，再取平均值。Caspase-3陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性反應(yīng)的強(qiáng)度分為-（≤10%），+（10%～30%），2+（30%～51%），3+（＞51%）。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，其在皮膚SCC、AK及正常皮膚的表皮組織中表達(dá)含量逐漸增加（圖1、2、3及表1）。16例皮膚SCC組織中6例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為37.50%，其中14例高分化皮膚SCC中6例表達(dá)陽(yáng)性，2例低分化皮膚SCC均表達(dá)陰性。27例 AK組織中14例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為51.85%。24例正常對(duì)照組中19例表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為79.17%。正常對(duì)照組Caspase-3的表達(dá)高于AK組及SCC組，三組間表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=7.60，P＜0.05）。

圖1　皮膚鱗狀細(xì)胞癌皮損中Caspase-3的表達(dá)（SP，×100）

圖2　光線性角化病皮損中Caspase-3的表達(dá)（SP，×100）

圖3　正常皮膚組織中Caspase-3的表達(dá)（SP，×100）

表1　Caspase-3蛋白在SCC、AK及正常皮膚中的表達(dá) 例

2.2Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達(dá)低于正常對(duì)照組（χ2=7.11，P＜0.01），在AK組織中的表達(dá)亦低于正常對(duì)照組（χ2=4.15，P＜0.05），Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達(dá)與AK組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2= 0.83，P＞0.05）。

2.3Caspase-3在皮膚SCC組織，尤其是異型細(xì)胞數(shù)量多的區(qū)域表達(dá)多呈陰性（10/16），在AK組織中表達(dá)仍以陰性（13/27）為主，少許中度陽(yáng)性（6/27）及強(qiáng)陽(yáng)性（5/27），而在正常對(duì)照組中，Caspase-3在表皮組織廣泛強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（11/24）。

3　討論

目前越來越多的學(xué)者認(rèn)為AK是一種皮膚原位癌，其實(shí)一開始就是從表皮棘細(xì)胞開始的鱗狀細(xì)胞癌，其作為一個(gè)多步衍生腫瘤的早期階段，以生物學(xué)統(tǒng)一體為特征，進(jìn)一步擴(kuò)散成鱗狀細(xì)胞癌［3-5］。國(guó)外有報(bào)道指出未治療的AK可發(fā)展為SCC。雖然每年僅約0.25%～20%的AK病變發(fā)展為SCC，然而60% 的SCC來源于AK［6］。

凋亡是在生命進(jìn)化過程中形成的保守的基本生命活動(dòng)之一，它能清除機(jī)體損傷、衰老或多余的細(xì)胞，是維持機(jī)體發(fā)育和自身組織穩(wěn)定的重要生命現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡的改變可以引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞中，Caspase家族居于重要地位。現(xiàn)認(rèn)為Caspase-3的激活是凋亡的最終通路［7］。Eckhart等［8］研究顯示，從Caspase-1～10，除Caspase-5外，其余 Caspases均在人類角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)。Lippens等［9］研究發(fā)現(xiàn)正常表皮中表達(dá)的Caspase-3無(wú)活性，而腫瘤組織中表達(dá)的Caspase-3有活性，提示Caspase-3與腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)。本研究中正常表皮組織中可見Caspase-3蛋白的廣泛性高表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)79.17%，明顯高于在AK組織表達(dá)陽(yáng)性率（51.85%）及皮膚SCC組織表達(dá)陽(yáng)性率（37.50%），且發(fā)現(xiàn)Caspase-3蛋白在皮膚SCC、AK及正常對(duì)照組織中的表達(dá)成逐漸增多的趨勢(shì)，三組間表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=7.60，P＜0.05）。從正常組織到AK，最后到皮膚SCC，Caspase-3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸降低，提示Caspase-3作為促凋亡因子，其表達(dá)的下降，可能導(dǎo)致AK及皮膚SCC的發(fā)生。促凋亡因子的低表達(dá)，抑制了細(xì)胞的凋亡過程，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖，此現(xiàn)象與通常的細(xì)胞凋亡理論相吻合。通常情況下，促凋亡因子的高表達(dá)可促進(jìn)凋亡的發(fā)生，引起腫瘤細(xì)胞死亡，從而抑制腫瘤的發(fā)展。我們的研究結(jié)果與邢君、陶菲克等［10，11］的文獻(xiàn)報(bào)道一致。本研究中Caspase-3在皮膚SCC組織中的表達(dá)與AK組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.83，P＞0.05），考慮與本研究中低分化皮膚 SCC組織標(biāo)本過少有關(guān)，從而推測(cè)Caspase-3表達(dá)含量可能與異型細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，異型細(xì)胞數(shù)量越多，分化程度越低，其表達(dá)含量越少。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Caspase-3蛋白表達(dá)與皮膚表皮腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，惡性程度越高，其表達(dá)含量越低。對(duì)Caspase-3蛋白的檢測(cè)可能有助于早期發(fā)現(xiàn)表皮腫瘤，尤其是皮膚SCC及AK，我們期望找到針對(duì)Caspase-3的靶位點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)治療，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)或者延緩腫瘤過程。然而，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間和條件的限制，我們尚未能找到相關(guān)的能夠阻斷該細(xì)胞調(diào)亡途徑的靶向治療藥物，期待以后的進(jìn)一步深入研究。此外，本實(shí)驗(yàn)僅采用免疫組化方法從蛋白水平研究Caspase-3在皮膚腫瘤中的表達(dá)，期待今后從DNA和RNA水平對(duì)其及相關(guān)因子進(jìn)行更深入的研究。

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（收稿：2016-01-08 修回：2016-02-29）

Expression of Caspase-3 in cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis

SHI Jian1，ZHANG Kejin2，MIAO Xu1，LIN Hua1，LIU Hongbin3，YANG Yang1.
1.Department of Dermatology，F(xiàn)irst People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China；2.Department of Dermatology，People's Hospital of Liaocheng，Liaocheng 252000，Shandong，China；3.Department of Pathology，F(xiàn)irst People's Hospital of Nantong，Nantong 226001，Jiangsu，China Corresponding author：SHI Jian，E-mail：jsntmcsj@163.com

Objective：To detect the level of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.Methods：The level of Caspase-3 in 16 lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，27 lesions of actinic keratosis and 24 normal skin was detected by immunohistochemistry method.Results：The positivity rate of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin tissues was 37.50%，51.85%and 79.17%respectively.The expression quantity of Caspase-3 in the lesions of cutaneous squamous cell carcinoma，actinic keratosis and normal skin was increased gradually.Conclusion：The down-regulated expression of Caspase-3 may be involved in the pathogenesis of cutaneous squamous cell carcinoma and actinic keratosis.

Caspase-3；cutaneous squamous cell carcinoma；actinic keratosis

施健，E-mail：jsntmcsj@163.com

南通市衛(wèi)生局青年科研基金項(xiàng)目（編號(hào)：WQ 2014003）

1南通市第一人民醫(yī)院皮膚科，江蘇南通，226001

2山東省聊城市人民醫(yī)院皮膚科，山東聊城，252000

3南通市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇南通，226001