王　艷　黃　萍　廖淑金

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院老年病科內(nèi)分泌?？?廣州 510180)

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·論著·

血糖波動(dòng)對糖尿病胃輕癱大鼠Cajal間質(zhì)細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究

王艷黃萍廖淑金

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院老年病科內(nèi)分泌?？?廣州 510180)

【摘要】目的探討糖尿病胃輕癱大鼠不同血糖水平對Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的影響及其機(jī)制。方法選擇雌性Wista大鼠60只進(jìn)行隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組40只，對照組20只。實(shí)驗(yàn)組糖尿病Wista大鼠模型以單次腹腔注射鏈脲佐菌素法誘導(dǎo)。免疫組織化學(xué)熒光染色檢測不同血糖濃度大鼠胃ICC數(shù)量及網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖濃度高于對照組，ICC數(shù)量，低于對照組，且比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠中血糖濃度越高，ICC數(shù)量越低，說明血糖濃度升高可能與平滑肌及神經(jīng)末梢之間縫隙連接的減少及其ICC網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)損傷及異常有關(guān)。結(jié)論DM小鼠胃組織中血糖水平的升高，可能是DM胃中ICC數(shù)量減少的原因；外源性降低血糖能改善DM相關(guān)的胃腸道ICC病變。

【關(guān)鍵詞】血糖糖尿病胃輕癱胰島素cajal間質(zhì)細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn),糖尿病胃輕癱患者及動(dòng)物模型存在平滑肌及神經(jīng)末梢之間縫隙連接的減少及其ICC網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)損傷及異常。因此ICC的異常可能是糖尿病胃輕癱的重要發(fā)病機(jī)制。本研究通過誘導(dǎo)糖尿病胃輕癱的Wista大鼠模型，檢測不同血糖濃度大鼠胃cajal間質(zhì)細(xì)胞變化，探討血糖波動(dòng)對糖尿病胃輕癱大鼠ICC的影響及其病理生理學(xué)機(jī)制。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級英國種短毛雌性Wista大鼠40只，體質(zhì)量170～230 g。實(shí)驗(yàn)Wista大鼠購于上海松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2糖尿病Wista大鼠模型建立使用全價(jià)飼料將60只Wista大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成2組：實(shí)驗(yàn)組40只，對照組20只。鏈尿佐菌素(STz，Sigma公司)溶于新鮮配制的濃度0.1 moL/L、pH 4.4枸櫞酸緩沖液中。正常對照組注射相應(yīng)劑量空白枸櫞酸緩沖液，實(shí)驗(yàn)組Wista大鼠按200 mg/kg體質(zhì)量單次腹腔注射STZ。3天后測定Wista大鼠血糖，每周1次，連續(xù)4周，隨機(jī)血糖≥16.7 mmoL/L為糖尿病Wista大鼠；血糖<16.7 mmoL/L為誘導(dǎo)失敗，在實(shí)驗(yàn)中摒棄。實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)成功糖尿病Wista大鼠40只。

1.3組織取材將Wista大鼠脫臼法處死，取出胃，反復(fù)用生理鹽水清洗，剔除胃黏膜層，部分胃組織剪成1 cm×1 cm組織塊，OCT包埋，液氮速凍保存，備行免疫組織化學(xué)染色。部分胃組織剪成1 mm×5 mm長條形存于5%戊二醛溶液中同定，以備用于透射電鏡觀察。

1.4免疫組織化學(xué)染色將胃組織于-20℃冰箱預(yù)冷20 min，用恒冷冰凍切片機(jī)切厚8 μm切片，黏于多聚賴氨酸處理的載玻片，晾干后，冷丙酮固定15 min，-20℃保存。室溫風(fēng)干切片、漂洗采用磷酸鹽緩沖液(PBS)、孵育采用l%牛血清白蛋白(BSA)。一抗為大鼠抗小鼠vimentin抗體(DAKO公司)及kif單克隆抗體(R&D公司)；二抗為鏈霉親和素一生物素一過氧化物酶復(fù)合物(SABC，大鼠IgG)-異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒及SABC(小鼠IgG)一cy3(武漢博士德公司)。4’，6．二脒基-2一苯基吲哚(DAPI)染色，甘油封片，熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察。每張切片選取3～5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇10個(gè)層面，每層0.3 μm的厚度進(jìn)行3D掃描。圖片用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行量化處理，以ICC與胃組織面積百分比進(jìn)行定量分析。

1.5激光共聚焦顯微鏡檢測將標(biāo)本放入Zam-boni液中固定，4℃6 h，行冰凍切片，將切好的冰凍組織切片(厚5 μm)放人冷丙酮固定，PBS沖洗；用5%BSA(溶于含0.3%Triton X-100的PBST中)封閉1 h；加入一抗(兔抗VAChT 1：100，羊抗C-Kit 1：100)，37℃孵育1.5 h，4℃過夜，PBS沖洗；加入二抗(FITC-驢抗羊IgG 1：200，TRITC一?？雇肐gG 1：200)，37℃避光孵育1 h，PBS沖洗；抗熒光衰減封片劑封片，鏡檢觀察。采用雙通道同步掃描，掃描分辨率1 024 dpi，每一標(biāo)本隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，用圖像分析軟件進(jìn)行圖像的三維重建和熒光值定量分析。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血糖、ICC數(shù)量的變化比較實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖濃度高于對照組，ICC數(shù)量，低于對照組，且比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組大鼠中血糖濃度越高，ICC數(shù)量越低，說明血糖濃度升高可能與平滑肌及神經(jīng)末梢之間縫隙連接的減少及其ICC網(wǎng)絡(luò)的超微結(jié)構(gòu)損傷及異常有關(guān)。見表1。

表1　各組大鼠血糖、ICC數(shù)量的變化比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2各組膽堿能神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化對照組ICC細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈梭形，有多個(gè)突起，ICC相互之間通過突起緊密連接，形成網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)。膽堿能神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完整。血糖16.7～20 mmol/L組和血糖21～25 mmol/L組ICC超微結(jié)構(gòu)較為正常完整，膽堿能神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)基本完整。血糖>30 mmol/L組和血糖26～30 mmol/L組ICC細(xì)胞形態(tài)模糊，數(shù)量較少，膽堿能神經(jīng)-ICC-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)紊亂。見圖1。

圖1　各組膽堿能神經(jīng)-ICC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的變化(X400)

A：對照組；B：血糖>30 mmol/L組；C：血糖16.7～20 mmol/L組；D：血糖21～25 mmol/L組；E：血糖26～30 mmol/L組。

3討論

糖尿病胃運(yùn)動(dòng)功能障礙是糖尿病常見的一種慢性并發(fā)癥,10年以上患者胃神經(jīng)肌肉功能異常發(fā)生率高達(dá)30%～50%,其主要特點(diǎn)是胃動(dòng)力下降、排空遲緩,從而導(dǎo)致胃潴留。糖尿病胃動(dòng)力障礙的發(fā)病機(jī)制尚未明確,目前認(rèn)為可能與植物神經(jīng)病變、平滑肌變性、高血糖等因素有關(guān)。Cajal間質(zhì)細(xì)胞是胃腸道的起搏細(xì)胞,ICC異常會(huì)影響平滑肌細(xì)胞內(nèi)的慢波,從而影響平滑肌正常的收縮運(yùn)動(dòng),導(dǎo)致整個(gè)胃腸動(dòng)力障礙。ICC產(chǎn)生慢波并傳導(dǎo)電興奮，參與神經(jīng)信號(hào)的傳遞，控制胃腸道運(yùn)動(dòng)h113；e-kit是ICC特異性表達(dá)的酪氨酸激酶受體。臨床研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者胃竇和結(jié)腸的ICC較非糖尿病者減少，同時(shí)存在ENS功能失衡，但胰島素治療對其影響尚不明確。在糖尿病胃腸功能紊亂的發(fā)病機(jī)制中，ENS起著重要作用。胃腸組織cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少及結(jié)構(gòu)破壞有關(guān);理論上控制血糖可改善或糾正ICC變化及相關(guān)癥狀。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠胃ENS的Ach陽性細(xì)胞較對照組染色加深，分布不均勻，空泡增多，面密度及累積光密度均低于健康對照組，這種變化在口服降糖藥組更顯著，提示糖尿病對Ach表達(dá)有明顯的破壞或抑制作用，而胰島素對上述變化有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖濃度高于對照組，ICC數(shù)量，低于對照組，且比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組大鼠中血糖濃度越高，ICC數(shù)量越低，說明血糖濃度升高可能與CC網(wǎng)絡(luò)的異常、超微結(jié)構(gòu)的損傷及其與神經(jīng)末梢及平滑肌之間縫隙連接的減少有關(guān)。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)DM小鼠經(jīng)外源性血糖干預(yù)后，血清中血糖與正常對照組相似，且ICC的數(shù)量、超微結(jié)構(gòu)得到部分改善，該結(jié)果與干預(yù)時(shí)間、給藥途徑、劑量等是否有關(guān)，尚待驗(yàn)證。提示DM小鼠胃組織中血糖水平的升高，可能是DM胃中ICC數(shù)量減少的原因；外源性降低血糖能改善DM相關(guān)的胃腸道ICC病變。

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DOI：10.3969/j.issn.1000-8535.2016.02.001

(收稿日期：2015- 09-15)

Effects of blood glucose fluctuations on Cajal interstitial cells of rats with diabetic gastroparesis an its mechanistic studies

WangYan,HuangPing,LiaoShujin.

DepartmentofGeriatrics，GuangzhouFirstPeople’sHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalCollege，Guangzhou510180，China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of glucose fluctuations on Cajal interstitial cells (ICC) of rats with diabetic gastroparesis(DGP) and its mechanistic.Methods60 Wistar rats were selected and randomly divided into two groups. 20 rats in experimental group and 40 rats in control group. Used immunofluorescence staining to detect the amount of gastric ICC and network structure in DGP rats with different glucose levels.ResultsThe blood glucose concentration in the experimental group was significantly higher than that in the control group, the amount of ICC in the experimental group was significantly lower than that in the control group(P<0.05). The amount of ICC decreased with the increase of glucose levels. In the experimental group, The gap junctions between smooth muscle and nerve endings, ultrastructural damage and abnormalities of the ICC network were probably related to glucose level.ConclusionThe increase of glucose level was probably the cause of the decrease of the amount in ICC. Exogenousy decrease glucose levels probably can help to improve the lesion of ICC with DGP.

【Key words】Blood glucose; Diabetes; Gastroparesis; Insulin; Cajal interstitial cells