王　艷,嚴　志,陳慧敏,熊毅敏,徐維田

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院,1.消化內(nèi)科; 2.心血管內(nèi)科,湖北 武漢,430070)

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微小RNA在人類壓瘡組織中的異常表達

王艷1,嚴志2,陳慧敏1,熊毅敏1,徐維田1

(廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院,1.消化內(nèi)科; 2.心血管內(nèi)科,湖北 武漢,430070)

摘要:目的建立人類壓瘡組織微小RNA表達譜。方法收集本院24例壓瘡組織臨床樣本，選取其中4例用于壓瘡微小RNA芯片制備。采用生物信息學(xué)算法比較壓瘡組織與正常組織中差異表達的微小RNA,獲得壓瘡微小RNA表達譜。進一步利用20例測試樣本，采用實時熒光定量-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)對所鑒定的表達譜進行驗證。結(jié)果獲得了12個差異表達的微小RNA,其中包括5個表達水平上調(diào)和7個表達水平下調(diào)的微小RNA,其中表達水平下調(diào)的miR-17差異表達水平最顯著。結(jié)論作者建立了一組由12個微小RNA組成的壓瘡組織微小RNA表達譜，為壓瘡發(fā)生及發(fā)展分子調(diào)控機制研究提供了豐富的素材。

關(guān)鍵詞:壓瘡; 微小RNA; 基因表達譜; miR-17

壓瘡是長期臥床患者常見的并發(fā)癥之一,發(fā)生壓瘡的老年患者病死率較未發(fā)生壓瘡老年人增加4～6倍[1]。導(dǎo)致壓瘡發(fā)生及影響其愈合的關(guān)鍵因素主要包括營養(yǎng)不良、局部組織血運欠佳、炎癥反應(yīng)等[2]。壓瘡發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機制尚不完全明確。利用高通量的生物學(xué)技術(shù)，結(jié)合優(yōu)化的生物信息學(xué)研究方法，系統(tǒng)地鑒定壓瘡組織相關(guān)分子標志物，是明確壓瘡發(fā)生、發(fā)展分子生物學(xué)機制、鑒定壓瘡早期診斷和預(yù)后判斷及尋找合適的臨床營養(yǎng)素的新途徑。

1材料與方法

1.1樣本收集及總RNA提取

在前期的工作中，作者從廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院收集了24例臨床壓瘡組織和20例正常皮膚、肌肉組織樣本用于本研究。樣本總RNA提取采用標準Trizol一步法:將組織標本利用液氮冷凍法破碎研磨，取壓瘡組織20 mg，加入1.5 mL進口EP管中，加入Trizol(TrizolTMReagent，Invitrogen公司)1 mL混勻。室溫下放置5 min。加入200 μL氯仿，混勻后室溫放置10～15 min。12 000 g,4 ℃，離心15 min,液體分為三相。取上層無色上清轉(zhuǎn)入1.5 mL進口EP管中。加入500 μL異丙醇，充分混勻后室溫放置10 min,沉淀RNA。12 000 g,4 ℃,離心10 min。棄上清，加預(yù)冷的1 mL 75%DEPC-H2O乙醇，洗滌RNA。7 500 g,4 ℃,離心5 min。棄上清，自然干燥沉淀。用50～80 μL DEPC-H2O溶解RNA。其中4對RNA樣本(4例壓瘡組織及4例正常組織樣本)用于微小RNA芯片制備，其余20對RNA樣本(20例壓瘡組織及20例正常組織樣本)作為測試樣本，采用實時熒光定量-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)驗證芯片結(jié)果。

1.2微小RNA芯片制備

微小RNA芯片購自Super Biotek Corporation公司 (http://www.superbiotek.com/，產(chǎn)品名稱Human oneArray v6 Microarrays)。芯片雜交結(jié)束后采用GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix公司)進行描儀。采用GenePix Pro 410圖像分析軟件(Axon Instruments公司)分析芯片圖像，將圖像信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，采用Lowess方法進行歸一化后獲得原始芯片數(shù)據(jù)。芯片雜交、數(shù)據(jù)掃描、數(shù)據(jù)歸一化均由上海卓立生物技術(shù)有限公司完成。

1.3微陣列顯著性分析方法和聚類分析

微陣列顯著性分析方法(SAM)是一種修正的t檢驗算法，屬于非監(jiān)督聚類分析方法，由斯坦福大學(xué)開發(fā)，軟件版本為SAM 3.11。作者采用變化倍數(shù)>1.5,q<0.05作為差異微小RNA篩選標準。所篩選出的差異微小RNA采用層次聚類分析方法進行圖像化，獲得壓瘡組織差異微小RNA表達譜。

1.4特異性微小RNA RT-PCR

利用前期獲得的壓瘡樣本總RNA，作者采用一種帶有固定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物進行特異性微小RNA逆轉(zhuǎn)錄[3]。逆轉(zhuǎn)錄程序為:16 ℃ 30 min,37℃ 30 min,70 ℃ 10 min。以所獲得的cDNA為模版，利用Oligo 6軟件設(shè)計上游和下游PCR引物。RT-PCR實驗采用RT-CyclerTM 436 系統(tǒng)，反應(yīng)體系為20 μL,包括2 μL cDNA,0.6 μL 20× Eva Green,0.5 μL 10 μmol/L上下游引物,0.5 μL 2.5 mmol/L dNTP,1.5 U Cap Taq polymerase,10 μL 2× PCR Buffer 和6.1 μL高壓去離子水。反應(yīng)程序如下:95 ℃,預(yù)變性5 min; 95 ℃,30 s; 56 ℃,30 s; 72 ℃,30 s; 共40個反應(yīng)循環(huán)。每個樣本采用3個平行管進行校正，取平均起峰閾值(Ct值)。本研究重點檢測了miR-17在壓瘡及正常組織中的差異表達水平，并以U6 snRNA的表達水平作為參照，采用2-ΔΔCT公式計算目的基因的相對表達水平[4],引物序列見表1。

表1　逆轉(zhuǎn)錄PCR實驗相關(guān)引物序列

1.5靶基因預(yù)測及信號通路分析

作者利用一種權(quán)威的微小RNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan miRNA(http://www.targetscan.org/)用于預(yù)測可能受miR-17所調(diào)控的靶基因。作者利用一個整合的基因功能注釋及信號通路分析數(shù)據(jù)庫MAS3.0 (http://www.capitalbio.com)進行靶基因信號通路分析。

2結(jié)果

2.1壓瘡組織微小RNA表達譜的建立

基于微小RNA芯片數(shù)據(jù)，作者采用SAM分析方法比較了4例壓瘡組織與4例正常組織的差異表達微小RNA,以變化倍數(shù)>1.5,q<0.05為篩選標準，獲得了由12個差異表達的微小RNA組成的壓瘡組織微小RNA表達譜，包括5個在壓瘡組織中上調(diào)和7個下調(diào)的微小RNA。見表2。聚類分析結(jié)果見圖1(壓瘡差異微小RNA表達譜包括12個差異表達的微小RNA，其中5個在壓瘡組織中上調(diào)，7個在壓瘡組織中下調(diào)。行:微小RNA; 列:樣本；PU:壓瘡樣本；NOR:正常樣本。黃色:表達水平上調(diào)；藍色:表達水平下調(diào)；黑色:無差異表達)。

表2　人類壓瘡組織微小RNA表達譜

圖1 壓瘡與正常組織差異表達微小RNA聚類分析

2.2RT-PCR實驗驗證

基于前期所鑒定的壓瘡微小RNA表達譜，作者篩選出了其中一個表達水平下調(diào)最顯著的miR-17(成熟體序列:caaagugcuuacagugcagguag)作為下一步研究對象。通過設(shè)計特異性微小RNA逆轉(zhuǎn)錄引物，采用RT-PCR方法檢測了20例測試樣本中miR-17在壓瘡組織及正常組織中的差異表達水平。實驗結(jié)果顯示，在20例壓瘡樣本中,16例低表達miR-17,4例高表達miR-17,下調(diào)率為80%。見圖2。

圖2 RT-PCR實驗驗證

2.3miR-17靶基因預(yù)測及信號通路分析

作者利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測了可能受miR-17調(diào)控的靶基因，獲得了1 220個潛在的靶基因位點，其中包括458互補序列大于8-mer的強結(jié)合位點(基因)。作者利用基因功能注釋及信號通路分析數(shù)據(jù)庫MAS 3.0進行靶基因信號通路分析。結(jié)果顯示，可能受miR-17調(diào)控靶基因參與多種信號通路，其中靶基因IL-8參與損傷修復(fù)控制、細胞凋亡、細胞因子及炎癥應(yīng)答等信號通路。見表3。這一分析結(jié)果有助于研究者更好地篩選壓瘡生物學(xué)特性相關(guān)分子標志物，進一步從分子生物學(xué)角度研究壓瘡的生物學(xué)進展。

表3　miR-17調(diào)控靶基因參與的信號通路分析

3討論

微陣列(microarray)技術(shù)是鑒定疾病相關(guān)分子標志物的重要手段之一，也是系統(tǒng)生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，目前已廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究及臨床[5]。研究人員利用microarray技術(shù)，建立了各種人類基因及microRNA表達譜，用于揭示人類疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制，并最終用于臨床分子診斷、預(yù)后判斷及治療。所建立的表達譜數(shù)據(jù)上傳至公共芯片數(shù)據(jù)庫，供研究人員參考及進一步分析，為人類疾病的科學(xué)研究及臨床應(yīng)用提供了豐富的素材。

微小RNA是真核生物中一類約22nt的非編碼小分子，其主要功能是通過與mRNA 3′端非編碼區(qū)特異結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或促進其降解，最終調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達。微小RNA在動物和植物中穩(wěn)定表達，可以作為人類疾病潛在的分子標志物[6-7]。微小RNA的表達模式呈多元性，每個miRNA可以調(diào)控多個靶基因，多個miRNA也可調(diào)控同一靶基因，異常表達的miRNA可以導(dǎo)致整個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的破壞或重組，與人類疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。微小RNA較mRNA和蛋白質(zhì)更為穩(wěn)定，更容易檢測。采用高通量的微陣列技術(shù)，能夠全面地檢測人類基因組中所有微小RNA的表達水平，有助于從系統(tǒng)生物學(xué)角度研究人類疾病，包括壓瘡發(fā)生、發(fā)展，為進一步研究壓瘡發(fā)生、發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制提供新的思路[8]。

本研究中，作者采用微陣列技術(shù)檢測了壓瘡樣本和正常組織中人類微小RNA的表達水平，進一步利用成熟的生物信息學(xué)分析方法，獲得了12個在壓瘡組織中異常表達的微小RNA。這一組異常表達的微小RNA有利于進一步研究壓瘡發(fā)生和發(fā)展過程中的分子生物學(xué)機制，更有可能將其作為早期診斷及預(yù)后判斷分子標志物應(yīng)用于臨床。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在所建立的壓瘡相關(guān)微小RNA表達譜中,miR-17在壓瘡組織中呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，其相對表達倍數(shù)超過3倍，這一異常表達狀態(tài)可能與壓瘡組織病理過程相關(guān)?，F(xiàn)有研究[9]表明，研究者所關(guān)注的miR-17與多種人類疾病相關(guān)。miR-17具有活化肝星狀細胞的能力,能夠促進胰腺β細胞及造血細胞增殖[10-11]。miR-17家族能夠調(diào)節(jié)非小細胞肺癌順鉑耐藥及轉(zhuǎn)移[12]，在胃癌組織中調(diào)節(jié)增殖相關(guān)原癌基因的表達[13]，是口腔和食管鱗狀細胞癌預(yù)后分子標志物[14-15]，具有抑制骨肉瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的潛能[16]，與人類多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后密切相關(guān)[17]。

然而，目前國內(nèi)外暫未有壓瘡組織生物學(xué)特性相關(guān)微小RNA的研究報道。本研究所建立的這一組壓瘡相關(guān)微小RNA表達譜為研究壓瘡組織生物學(xué)特性提供了的研究素材，為進一步從分子生物學(xué)角度研究壓瘡的發(fā)生、發(fā)展提供新的思路。

參考文獻

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收稿日期:2016-03-12

基金項目:湖北省自然科學(xué)基金資助項目(2012FFB06806); 湖北省衛(wèi)生廳2013-2014年度科研項目(HL2012-8)

中圖分類號:R 334

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-024-04

DOI:10.7619/jcmp.201615007

Abdominal expression of microRNA in tissue of human pressure ulcers

WANG Yan1,YAN Zhi2,CHEN Huimin1,XIONG Yimin1,XU Weitian1

(1.Department of Gastroenterology; 2.Department of Cardiovascular Medicine, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan,Hubei,430070)

ABSTRACT:ObjectiveTo establish microRNA expression profile in tissue of human pressure ulcer (PU).MethodsClinical samples of 24 patients with PU were selected,and 4 samples was used for preparation of micro RNA chip for pressure ulcer.Bioinformatics algorithms significant analysis of microarray (SAM) was used to identify differential expression of microRNAs,and real-time PCR was used to validate the candidate biomarkers in 20 test samples.ResultsA total of 12 differential miRNAs were selected as candidate biomarkers by using SAM algorithm,including 5 up-regulated and 7 down-regulated miRNAs in PU.The differential expression level of down-regulated miR-17 was the most significant.ConclusionAuthors establish a set of small RNA expression profile of pressure ulcer tissue composed of 12 tiny RNA,which provides rich materials for the research of the mechanism of the occurrence and development of pressure ulcers.

KEYWORDS:pressure ulcer; microRNA; gene expression profiles; miR-17