張阿惜,連英竹,沈月峰,付桂明,3,萬 茵,*

(1.南昌大學(xué),食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,食品學(xué)院,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西南昌 330031; 3.南昌大學(xué)中德食品工程中心,江西南昌 330047)

毛蕊花苷作為天然化合物主要分布在車前子、玄參和肉蓯蓉等雙子葉植物中,屬于典型的苯乙醇苷類物質(zhì)[1]。毛蕊花苷的結(jié)構(gòu)由四個(gè)單元組成,其中咖啡酸和4,5-二羥基苯乙醇(羥基酪醇)以及鼠李糖單元分別通過酯鍵和糖苷鍵連接到中心葡萄糖上。近年來發(fā)現(xiàn)毛蕊花苷具有良好的抗氧化[2]、抗炎[3]、保肝[4]、抗菌[3]、抗癌[5]、降血壓[6]、抗腫瘤[7]及改善神經(jīng)細(xì)胞凋零[8]等多種生理活性,說明毛蕊花苷在天然藥物和保健品研發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-11]。但是,毛蕊花苷的結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化,一定程度上限制了它的開發(fā)利用。如Vertuani等[7]研究發(fā)現(xiàn)毛蕊花苷在弱酸性環(huán)境下(pH5)放置60 d后穩(wěn)定性較好,回收率為73%,pH6時(shí)毛蕊花苷的穩(wěn)定性居中,回收率為10%左右,而在中性環(huán)境(pH7)室溫保存3周已基本降解完全。Zhou等[12]發(fā)現(xiàn)高溫、堿性及光照條件下儲(chǔ)存的毛蕊花苷異構(gòu)化成了異毛蕊花苷。然而有文獻(xiàn)表明異毛蕊花苷在降尿酸方面效果不及毛蕊花苷。曾金祥等[13]研究結(jié)果表明,異毛蕊花苷有一定降尿酸作用,但降尿酸能力遠(yuǎn)小于毛蕊花苷,其對黃嘌呤氧化酶亦無顯著抑制作用。因此,保證毛蕊花苷的穩(wěn)定性且防止其發(fā)生轉(zhuǎn)化對于毛蕊花苷的應(yīng)用具有至關(guān)重要的意義。目前關(guān)于毛蕊花苷穩(wěn)定性的研究大多只是監(jiān)測其在不同環(huán)境下的含量變化,關(guān)于毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)僅有個(gè)別報(bào)道[12],且其選擇考察的水平點(diǎn)范圍較小,如未研究常用的加工溫度60和100 ℃;未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于車前子來源的毛蕊花苷降解動(dòng)力學(xué)的研究。

毛蕊花苷分布廣泛且藥用價(jià)值高,但其在不同溫度、pH、光照條件下的不穩(wěn)定性,嚴(yán)重影響其含量測定、消化吸收、體內(nèi)外活性等研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和實(shí)用性,因此本文研究并建立了其在不同溫度、pH、光照條件下各自的降解半衰期和降解動(dòng)力學(xué)方法,分析了降解過程中各參數(shù)的變化規(guī)律,并推導(dǎo)了其熱降解動(dòng)力學(xué)方程,且建立了熱降解動(dòng)力學(xué)模型,以期為有效控制毛蕊花苷的降解提供理論依據(jù),從而為進(jìn)一步確保毛蕊花苷的穩(wěn)定性使其更加廣泛地應(yīng)用到天然保健品開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

毛蕊花苷(液相純度98.8%) 本實(shí)驗(yàn)室利用柱層析、制備液相色譜技術(shù)從車前子中提取分離獲得[14];甲醇(色譜級) Honeywell公司;蒸餾水 屈臣氏公司。

Waters e2695高效液相色譜儀 Waters公司;FA1604精密電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;DKS-24型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋 嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;SevenEasyS20臺(tái)式pH酸度計(jì) 上海梅特勒-托利多公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC測定條件 Waters e2695型高效液相色譜儀;色譜柱:Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測器:2998 PDA二極管陣列檢測器;檢測波長:330 nm;流速0.6 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:甲醇(A):0.1%甲酸水溶液(B),比例為40∶60;柱溫35 ℃。

1.2.2 毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究

1.2.2.1 光照、避光下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究 參照Zhou等[12]研究方法,配制濃度為30 μg/mL的毛蕊花苷對照品溶液。分別取14份毛蕊花苷對照品溶液10 mL于試管中,室溫(20 ℃)下分別置于光照和暗箱環(huán)境中,間隔0、1、2、3、4、5、6 d取樣,HPLC測定其含量,并確定反應(yīng)級數(shù),計(jì)算降解半衰期。

1.2.2.2 不同溫度下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究 參照Zhou等[12]研究方法,為了考察毛蕊花苷在人體正常溫度、旋蒸濃縮溫度、超聲提取溫度、水溶液沸騰溫度下的穩(wěn)定性,分別取5份毛蕊花苷對照品溶液10 mL于試管中,于避光條件下分別置于37、50、60、80、100 ℃的恒溫水浴鍋中,在37和50 ℃下間隔0、24、48、72、96、120 h,在60和80 ℃下間隔0、1、2、3、4、5 h,在100 ℃下間隔0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,取樣,迅速降至室溫后,以未作處理的毛蕊花苷對照品溶液作空白,于HPLC測定條件下測定其含量,確定反應(yīng)級數(shù),計(jì)算降解半衰期。

1.2.2.3 不同pH條件下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究 為了考察毛蕊花苷在強(qiáng)酸性、弱酸性、中性、弱堿性條件下的穩(wěn)定性,本文研究了毛蕊花苷在pH2、6、7、8條件下的降解動(dòng)力學(xué)。稱取一定量的毛蕊花苷加入到用鹽酸或氫氧化鈉配制pH分別為2、6、7、8的水溶液中,并將該溶液中毛蕊花苷終濃度調(diào)整至30 μg/mL,搖勻,于避光、37 ℃條件下放置。分別于樣品制備后0、2、4、6、8、10 h取樣,以未作處理的毛蕊花苷對照品溶液作對照。于HPLC測定條件下測定其含量,確定反應(yīng)級數(shù),計(jì)算降解半衰期。

1.2.3 反應(yīng)級數(shù)的確定 參照文獻(xiàn)[15-16]測定。利用零級、一級和二級動(dòng)力學(xué)公式計(jì)算毛蕊花苷的降解速率,然后進(jìn)行線性回歸分析,比較決定系數(shù),零級動(dòng)力學(xué)方程如式(1)所示:

C-C0=-Kt

式(1)

一級動(dòng)力學(xué)方程如式(2)所示:

-ln(C/C0)=Kt

式(2)

二級動(dòng)力學(xué)方程如式(3)所示:

式(3)

式中:C為在處理t時(shí)間后的毛蕊花苷濃度,μg/mL;C0為毛蕊花苷起始濃度,μg/mL;K為一級反應(yīng)速率常數(shù),h-1;t為處理時(shí)間,h。

1.2.4 降解動(dòng)力學(xué)模型的確定 參照文獻(xiàn)[16-18]測定。表觀活化能Ea和K0可以從一級反應(yīng)速率常數(shù)的對數(shù)(lnK)對熱力學(xué)溫度的倒數(shù)(1/T)的作圖中求出:現(xiàn)假設(shè)毛蕊花苷的降解符合Arrhenius方程如式(4)所示。

式(4)

則可預(yù)測動(dòng)力學(xué)模型如式(5)所示。

式(5)

式中:t為從C到C0所需時(shí)間,h;K為一級反應(yīng)速率常數(shù),h-1;K0為頻率常數(shù),h-1;Ea為表觀活化能,kJ/mol;R為摩爾氣體常數(shù),8.314J/(mol·K);T為開爾文溫度,K。

1.2.5 半衰期的計(jì)算 參照文獻(xiàn)[19-21]測定,半衰期計(jì)算方程如式(6)所示。

T1/2=-ln0.5×(1/K)

式(6)

式中:T1/2為半衰期(毛蕊花苷保存率為50%的時(shí)間),K為一級反應(yīng)速率常數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析(P<0.05),并用Origin 9.0作圖,以上所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

表2 溫度與毛蕊花苷降解速率的關(guān)系Table 2 Relationship between temperatures and degradation rates of verbascoside

2 結(jié)果與分析

2.1 光照/避光條件下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)

2.1.1 反應(yīng)級數(shù)的確定 光照/避光條件下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)中反應(yīng)級數(shù)研究結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,毛蕊花苷-ln(C/C0)與t的關(guān)系函數(shù)斜率即黑暗條件下的反應(yīng)速率常數(shù)明顯要比光照條件下小,說明在長時(shí)間內(nèi),避光對毛蕊花苷的保護(hù)作用很好。Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)在避光和光照條件下毛蕊花苷標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)速率常數(shù)分別為0.0054和0.0124 day-1,光照條件下毛蕊花苷會(huì)轉(zhuǎn)變成咖啡酸單元和羥基酪醇單元,并異構(gòu)化為異毛蕊花苷。光照和避光下毛蕊花苷的線性決定系數(shù)都接近1,可見,相關(guān)性很好,即-ln(C/C0)與t呈線性關(guān)系,降解反應(yīng)屬于一級反應(yīng)。

圖1 光照和避光下毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖Fig.1 Changes of-ln(C/C0)with timefor verbascoside in the dark and light注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2、圖4同。

2.1.2 降解半衰期的確定 由于前期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果以及Zhou等[12]研究中,均表明20 ℃下,毛蕊花苷較穩(wěn)定。本文此處主要觀察在體溫、加工溫度下的穩(wěn)定性。在光照和避光條件下的降解半衰期如表1所示。由表1可以看出,毛蕊花苷在光照和避光時(shí)的半衰期均低于Zhou等[12]的數(shù)據(jù),可能原因是Zhou等研究的對象為從桂花中提取得到的毛蕊花苷,且其研究的試驗(yàn)條件為pH6,與本文研究的毛蕊花苷來源和pH條件不同。避光條件下,毛蕊花苷半衰期為295.0 h,光照下毛蕊花苷的反應(yīng)速率常數(shù)大約是避光下的1.5倍,半衰期大約是避光下的3/5,說明避光下的毛蕊花苷穩(wěn)定性較好,易于保存,這與Zhou等[12]的研究結(jié)果相吻合,因此,本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用避光處理。

表1 光照和避光下毛蕊花苷的降解半衰期Table 1 Half-life time values ofverbascoside in the dark and light

2.2 不同溫度下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 反應(yīng)級數(shù)的確定 不同溫度下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)中反應(yīng)級數(shù)的研究結(jié)果如圖2所示。由圖2A和2B可知,毛蕊花苷在37和50 ℃恒溫水浴中,隨著時(shí)間的增加,降解速率較為緩慢,尤其是在37 ℃條件下。由圖2C可知,毛蕊花苷在60～100 ℃高溫水浴中-ln(C/C0)與t的一次函數(shù)斜率增大,即反應(yīng)速率常數(shù)K增大,說明即使在避光條件下,毛蕊花苷在高溫也非常不穩(wěn)定。毛蕊花苷在100 ℃的水浴中孵育2.5 h后降解率為82.53%,可見,溫度越高,對毛蕊花苷的破壞性越大,而在37 ℃下孵育120 h后降解率為24.90%,說明加熱時(shí)間越長,對毛蕊花苷的降解率越高。Wong等[22]也發(fā)現(xiàn)將161 μg/mL毛蕊花苷置于暗處煮沸(100 ℃)8 h,約80%毛蕊花苷會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惷锘ㄜ?。從圖2A和2B可知,毛蕊花苷在37、50 ℃恒溫水浴中,在20 h內(nèi),隨著時(shí)間的增加,含量基本不會(huì)減小。圖2中,在37、50、60、80、100 ℃下,毛蕊花苷的線性決定系數(shù)R2均接近1,即-ln(C/C0)與t呈線性關(guān)系,降解反應(yīng)屬于一級反應(yīng)。

圖2 不同溫度條件下毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖Fig.2 Changes of-ln(C/C0)with time for verbascoside at different temperatures注:A為37 ℃時(shí)毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖;B為50 ℃時(shí)毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖;C為60 ℃時(shí)毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖;D為80 ℃時(shí)毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖;E為100 ℃時(shí)毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖。

2.2.2 分析降解動(dòng)力學(xué)模型 由預(yù)測模型可知,只須求出K0和Ea,就可建立起毛蕊花苷的降解模型。由lnK=-Ea/RT+lnK0可知,以1/T為橫坐標(biāo),以lnK為縱坐標(biāo)作線性方程,斜率為-Ea/R,截距為lnK0,結(jié)果如表2和圖3所示。

圖3 毛蕊花苷降解速率與溫度的關(guān)系圖Fig.3 Arrhenius plot of verbascoside

2.2.3 降解半衰期的確定 各個(gè)溫度下的降解半衰期如表3所示。由表3可知,隨著溫度的升高,反應(yīng)速率常數(shù)K增大,半衰期t1/2減小,說明毛蕊花苷的降解速率隨溫度的升高而加快。由毛蕊花苷的半衰期變化可以知道,毛蕊花苷不耐熱,低溫有助于延長毛蕊花苷的保存期,37 ℃下半衰期為288.8 h。Zhou等[12]也提出毛蕊花苷的半衰期隨溫度的升高而下降。所以毛蕊花苷適宜在低溫下貯存。

表3 不同溫度下毛蕊花苷的降解半衰期Table 3 Half-life time valuesof verbascoside at different temperatures

2.3 不同pH環(huán)境下毛蕊花苷的降解動(dòng)力學(xué)研究

2.3.1 反應(yīng)級數(shù)的確定 由圖4可知,pH2、6、7、8中毛蕊花苷的-ln(C/C0)與t的一次函數(shù)圖像斜率相差較大,即pH2、6、7、8中毛蕊花苷的反應(yīng)速率常數(shù)K呈遞增關(guān)系。說明在低pH、中性、堿性環(huán)境中毛蕊花苷的穩(wěn)定性相差較大。pH2中毛蕊花苷的-ln(C/C0)與t的一次函數(shù)斜率即反應(yīng)速率常數(shù)K明顯小于pH6、7、8,說明在低pH中,毛蕊花苷的穩(wěn)定性較好。且pH2、6、7、8中毛蕊花苷-ln(C/C0)與t的線性決定系數(shù)均接近1,可見相關(guān)性很好,降解反應(yīng)屬于一級反應(yīng)[12]。

圖4 不同pH條件下毛蕊花苷-ln(C/C0)與t關(guān)系圖Fig.4 Changes of-ln(C/C0)with time for verbascoside at different pH values

2.3.2 降解半衰期的確定 各個(gè)pH下的降解半衰期如表4所示。由表4可以看出,在pH2、6、7、8下,除了pH2之外三種pH條件下毛蕊花苷的反應(yīng)速率常數(shù)較大,半衰期較短,pH2條件下毛蕊花苷較穩(wěn)定,變化不大,半衰期較長(74.5 h),說明低pH對毛蕊花苷影響不大,因此毛蕊花苷適合在低pH條件下保存[23-25],D’Imperio等[2]也證明了這個(gè)結(jié)論,指出毛蕊花苷在pH3環(huán)境下穩(wěn)定性大于pH7,24 h后回收率幾乎100%,而在中性環(huán)境中毛蕊花苷回收率為62.4%,且異構(gòu)化為異毛蕊花苷。毛蕊花苷的分子結(jié)構(gòu)中存在鄰二酚羥基和糖苷鍵,在中性或堿性情況下久置易發(fā)生氧化分解[26],Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)在pH5～7時(shí),毛蕊花苷的主要降解產(chǎn)物為咖啡酸、羥基酪醇和異毛蕊花苷。

表4 不同pH下毛蕊花苷的降解半衰期Table 4 Half-life time values ofverbascoside at different pH values

3 結(jié)論

研究表明在不同溫度、pH、光照和避光條件下,毛蕊花苷的降解反應(yīng)均屬于一級反應(yīng)。通過對毛蕊花苷在這三種條件下降解動(dòng)力學(xué)的研究,從而可以預(yù)測不同條件下三者的降解時(shí)間。目前,結(jié)果表明低溫、低pH及避光條件對毛蕊花苷的保護(hù)作用明顯。光照下毛蕊花苷的反應(yīng)速率常數(shù)大約是避光下的1.5倍,半衰期大約是避光下的3/5,說明避光下的毛蕊花苷穩(wěn)定性較好,易于保存。避光、37 ℃、pH2條件下毛蕊花苷較穩(wěn)定,半衰期明顯延長。本文深入探討影響毛蕊花苷穩(wěn)定性的因素及對其進(jìn)行分析,為車前子、玄參和肉蓯蓉等富含毛蕊花苷的天然保健食品資源植物的加工工藝參數(shù)的優(yōu)化及毛蕊花苷提取、純化過程和其在機(jī)體胃腸道中的穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)。